Protéines de Stress : marqueurs de protéotoxicité

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1 Protéines de Stress : marqueurs de protéotoxicité

2 Qu’est ce que les Hsp ? Hsp 100 Hsp 90 Hsp 70 Hsp 60 Hsp de faible PM
Hsp : Heat Shock Proteins Ritossa, 1962 : Choc thermique Classées en plusieurs familles Hsp 100 Hsp 90 Hsp 70 Hsp 60 Hsp de faible PM Hsp 70 : hautement conservées

3 Transport sub-cellulaire des protéines
Hsp constitutives Transport sub-cellulaire des protéines Repliment des protéines natives Réparation des protéines dénaturées Dégradation des protéines non réparées Chaperons moléculaires

4 Hsp inductibles Cytoprotection Bactérie, Levure, Organismes supérieurs
Tous les systèmes vivants Bactérie, Levure, Organismes supérieurs Plusieurs agents inducteurs Fièvre, Infection virale, …. Stress oxydatif Métauds lourds Xénobiotiques Cytoprotection

5 Différents facteurs d’induction des familles de Hsp
Agents de stress (dénaturation protéique): Choc thermique Alcool Rayons ultraviolets Métaux lourds Oxydants Chimiothérapie Hsp110 Hsp90 Hsp70 Hsp60 Altération de l’état physiologique (augmentation de la synthèse protéique): Hsp27 Cycle cellulaire Facteurs de croissance Infection, inflammation Récupération à hypoxie ou carence en glucose

6 Hsp et Toxicologie moléculaire
Les protéines de choc thermique se lient à des protéines dégradées par un stress et évitent leur agrégation et rétablissent leur fonctions Mécanismes d’induction : protétoxicité L’induction des Hsp : réponse sensible et précoce réponse dose et temps dépendante Hsp 70: Marqueurs de toxicité universels non spécifiques

7 Quels rôles jouent les Hsp ?
1) Assiste le repliment des protéines dans différents compartiments cellulaires 2) Assure le maintien des structures tri-dimentionnelles des protéines, 3) Asssite le repliement correcte des protéines dénaturées 4) Assure la translocation des protéines à travers les differents compartiment cellulaires, 5) Prévient de l’aggrégation des protéines 6) Dégrade des protéines instables

8 HSP Family Cellular Location Proposed Function HSP27 (sHSP) Cytosol, nucleus Microfilament stabilization, antiapoptotic HSP60 Mitochondria Refolds proteins and prevents aggregation of denatured proteins, proapoptotic HSP70 family: Antiapoptotic   HSP72 (Hsp70) Protein folding, cytoprotection   HSP73 (Hsc70) Molecular chaperones   HSP75 (mHSP70)   HSP78 (GRP78) ER Cytoprotection, molecular chaperones HSP90 Cytosol, ER, nucleus Regulation of steroid hormone receptors, protein translocation HSP110/104 Cytosol Protein folding Table  1.   Cellular locations and proposed functions of mammalian heat shock protein familiesHSP, heat shock protein; sHSP, small HSP; ER, endoplasmic reticulum.

9 La famille des Hsp 70 HSP70 sont les plus inductibles et les plus conservées Elles présentent 60-80% d’homologie dans le monde des eucaryotes

10 Mécanisme d’induction des Hsp 70

11 Provoque-t-elle une protéo-toxicité ?
La zéaralénone induit-elle l’expression des Hsp 70 ? Provoque-t-elle une protéo-toxicité ? Laboratoire de Recherche sur les Substances Biologiquement Compatibles (LRSBC)

12 Objectifs Étudier la cytotoxicité de la ZEN
Étudier l’expression des Hsp 70 et leur potentiel cytoprotecteur

13 Modèle in vitro : Hep G2 Activation métabolique (-, -zearalenol)
Modèle retenu pour la réponse Hsp Hépatocytes humains Activation métabolique (-, -zearalenol) Le foie est une cible préférentielle de la ZEN

14 Cas de la ZEN / Hep G2 Viabilité cellulaire Viabilité (% du control)
Inhibition dose dépendante de la viabilité CI50 = 95 µM

15 Comment peut-on déterminer le niveau d’expression d’une protéine bien déterminée au niveau d’une population cellulaire ou à partir d’un tissu ou organe ?

16 Démarche Traitement des cellules avec des concentrations croissantes de ZEN Extraction des protéines cellulaires Séparation des protéines par électrophorèse Transfert des protéines Immunodétection de la protéine d’intérêt

17 1. Sites inoccupés par les protéines transférées bloqués
2. Anticorps monoclonal anti-Hsp 70 de souris 3. Anticorps anti-IgG de souris couplé à la phosphatase alcaline 4. Phosphatase alcaline 5. S. Substrats révélateurs de l’activité phosphatase alcaline NBT/ BCIP P. Précipité coloré, produit de la réaction catalysée par la phosphatase alcaline en présence de NBT, BCIP sur le site du complexe antigène anticorps

18 Résultats

19 Expression des Hsp 70 6h 12h 24h

20 h Choc thermique C µM ZEN : 120 µM C µM CTN : 260 µM C nM T-2 toxine : 110 nM La ZEN, CTN et T-2 toxine sont cytotoxiques et induisent l’expression des Hsp 70 d’une manière dose dépendante

21 Cas de l’OTA : Hep G2 /Vero
Viability (% of control) OTA : cytotoxique pour les Hep G2 et les Vero (CI 50: 90 et 120 µM)

22 OTA et expression des Hsp 70