Elise KRATTINGER Rhevir 2006

Présentation au sujet: "Elise KRATTINGER Rhevir 2006"— Transcription de la présentation:

1 Elise KRATTINGER Rhevir 2006
Épidémiologie régionale du VHC A propos d’une nouvelle technique de génotypage Elise KRATTINGER Rhevir 2006

2 I.Généralités

3 L’hépatite virale C… VHC VIH Problème de santé publique
Prévalence mondiale: 180 millions (3%) France: personnes (1%) nouveaux cas/an Chronicité: 80%, cirrhose: 20%, CHC: 4% 1ère cause de transplantation hépatique en Europe Mortalité: 3000/an Prévalence VHC= 4 x HIV VIH 35 000 VHC

4 Transmission Voie parentérale: Autres voies Cas sporadiques (30%)
Transfusion sang et hémodérivés (1ère cause AVANT 1991) Toxicomanie intraveineuse (1ère cause DEPUIS 1991) Autres voies Nosocomiale (3 à 10%): dialyse,chirurgie lourde, endoscopie avec biopsie Professionnelle: 3 à 5% Verticale: 5-10% (20% si VIH+) Sexuelle ? peu probable… Autres: piercing, tatouage, acupuncture, soins dentaires Cas sporadiques (30%)

5 Variabilité génétique
Caractéristique du VHC Absence d’activité « proofreading» de l’ARN polymérase Variabilité +/- marquée selon les régions 5’NC, core  région conservée NS5b, E1, E2 (domaine hypervariable HRV1) pression de sélection Classification Types : Homologie > 70% Sous-types: homologie > 80% Isolats: homologie > 90% Concept de quasi-espèces 6 génotypes >70 sous-types

6 Impact de la variabilité (1)
Association génotype et distribution géographique Mellor J et al, J Gen Virol, 1995 1,2,3 répartition ubiquitaire 4,5,6 distribution localisée Association génotype et mode de contamination Pawlotsky JM et al, J Infect Disease,1995 1b, 2 et 5  transfusion 1a, 3 et 4  toxicomanie  Génotype = traceur épidémiologique

7 Prévalence et distribution géographiques des types et sous-types du VHC

8 Impact de la variabilité (2)
Association génotype et clinique Génotype 1 plus sévère ?  controversé Fattovich G et al, J Viral Hepat, 2001 Génotype 3 et stéatose  à préciser Rubbia-Brandt L et al, Histopathology, 2001 Association génotype et thérapeutique/prévention Martinot-Peignoux M et al, Hepatology, 1995 2, 3  PegIFN-riba 24 sem  80% RVP 1, 4  PegIFN-riba 48 sem  50% RVP Hypothèse d’un vaccin illusoire…  Génotype = marqueur pronostique

9 II.Etude épidémiologique régionale 1993-2005

10 Étude épidémiologique régionale
Objectif: épidémiologie descriptive VHC de 1993 à 2005 en Languedoc-Roussillon Outil: Fiche épidémiologique réseau VHC État civil: sexe, âge, origine géographique Biologie: sérologie VHC, coinfection (VIH, VHB) Virologie: ARN qualitatif, génotype, charge virale Mode de contamination présumé, antécédents médicochirurgicaux Traitement: naïf, répondeur, rechuteur

11 Patients et prescripteurs
Juin 1993-décembre 2005 CH du réseau RHEVIR 9862 patients, 43 ans 4028 femmes (40,8%) 5834 hommes (59,2%) Prescripteurs Médecine: 43% Hépatologie: 30% Externes: 8.6% Chirurgie: 6.1% Psychiatrie: 3.8% Obstétrique: 3.7% Néphrologie: 2.7% Méd préventive: 1.4%

12 Données biologiques ARN +: 72% (n=6090) Génotypage: 42% (n=4179)
Co-infections: 11% VIH: 13% (n=842) VHB: 8% (n=340)

13 Génotypes et mode de contamination

14 Génotypes et sexe/âge

15 Tendances évolutives

16 Le toxicomane / Le transfusé 63% (n=1094) Homme: 72%; 34 ans
ARN + (71%) Génotype 3a (36%) 1a (23%) 4 (10%) Co-infections VIH (39%) VHB (25%) 18% (n=324) Femme: 58%; 51 ans ARN + (90%) Génotype 1b (38%) 3 (19,18%) 2 (16%) Co-infections VIH (8%) VHB (6%)

17 Conclusions Contamination par voie parentérale: 82%
Évolution des 2 endémies du VHC  Principal FR: Usage de drogues IV  Glissement génotypes 1b vers 3a  Conséquences cliniques et thérapeutiques Exposition nosocomiale et « Autres causes »: 18% Biais concernant le groupe « Non renseignés » Données méconnues, perdues, oubliées… Groupe hétérogène

18 III. Etude d’une nouvelle technique de génotypage

19 Techniques de génotypage
Actuellement… Séquençage région 5’ NC ou NS5b/E1 (technique de référence): TRUGENE® (Bayer) Hybridation moléculaire: LIPA HCV II® (Bayer) Récemment… Typage par PCR temps réel (région 5’NC)

20 Applications Objectifs:
Projet de typage régional VHC Mise au point technique (I.Dorval, 2004) Validation au CHU Montpellier Patients: n= 208 patients « nouveaux VHC + » en 2005 Méthodes: Analyse courbes de fusion post-PCR temps réel Light Cycler (Roche®) Comparaison au LIPA Séquençage des souches discordantes

21 Hybridation sur membrane

22 Typage sur Light Cycler
Extraction ARN viral sur colonne RT-PCR en temps réel (sondes d’hybridation) Courbe de fusion

23 Principe des sondes d’hybridation
5’ 3’ Amorce Sens Amorce anti-sens Sondes d‘hybridation F1 F2 Sonde Anchor séquence conservée commune à tous les génotypes Sonde Sensor séquence spécifique de chaque génotype

24 Typage avec sondes d’hybridation
t° désappariement= f(homologie sonde/séquence)

25 RT-PCR 2.Courbe de fusion 3.(-dF/dT)/T°C Fluo= f(n cycle)
Dénaturation de l’ADN par  t° 3.(-dF/dT)/T°C Tm= 50% brins dissociés 1 génotype = 1 Tm

26 Résultats (1)

27 Résultats (2)

28 Résultats (3) LIPA  Concordance: 97,1% 1 1a 1b 1a1b 2 2a 2a2c 3 3a 4
FUSION 1 1a 1b 1a1b 2 2a 2a2c 3 3a 4 4a 4c4d 4e 5a Total 1 ou 6 9 37 58 11 115 2 ou 5 5 7 24 42 50 8 6 18 10 38 207  Concordance: 97,1%

29 Analyse des souches discordantes
Résultats (4) Souche LIPA FUSION SEQ 13960 3a Tm (i) QI 13718 4 2 ou 5 4a 14042 4e 3 13738 2 14026 2a/2c 2a 13924 1 14097 1a

30 Discussion (1): région étudiée
Région 5’NC Région la plus utilisée pour le typage Mais… -Moins adaptée pour certains types (2 et 4) -Mutations de polymorphismes mésappariement sondes/séquence virale  erreurs de typage ? Infections mixtes Détection  population amplifiée > 25% Sous-estimation avec méthodes PCR ?

31 Discussion (2): design des sondes
Génotype 1=6, Génotype 2=5 Sous typage impossible  aucun intérêt clinique Sondes spécifiques du génotype 1 Tm (°) G5 60,10° 50 55 60 65 G3 52,66° G4 55,89° G2 60,45° G1 64,01°

32 Discussion (3): formats de fluorescence
SYBRGreen: simple, peu coûteux mais manque de spécificité Takemura et al, Rinsho Byori, 2004 Fujigaki H et al, Ann Clin Biochem, 2004 Sondes Taqman: bons résultats mais multiplication sondes, mix, coût Lindh M et al, Journal of Clinical Virology, 2005 Rolfe KJ et al. J Clin Virol, 2005 Moghaddam, A. Journal of Viral Hepatitis, 2006 Sondes d’hybridation  pistes optimisation 1 couple de sondes: Haverstick, DM, Clinical Chemistry, 2004 3 couples de sondes et 2 canaux de fluorescence Schroter M et al, Journal of clinical microbiology. 2002

33 Spécificité sondes pour G2, G5, G6
LIPA SEQUENCAGE LIGHT CYCLER Sous typage OUI NON Équipement + ++ Durée test 8h 3h Limites Erreur sous typage Difficultés techniques Spécificité sondes pour G2, G5, G6 Coût (€) 80 75 <10

34 Conclusions… Typage 88% des génotypes locaux (1, 3 et 4)
Avantages des techniques « en temps-réel » Pas de manipulation post-PCR Rapide, coût  Limites: Génotypes 2 et 5 (12% des génotypes locaux et pronostic différents) Quantification + typage oui mais…pour génotype 1 Agrément CE Mais…optimisation technique possible:  nb couples de sondes, sondes MGB  canaux de fluorescence

35 Et perspectives… Typage en routine au laboratoire
Application pour les PVD ?