Claude Husson, Pascal Frey, Jean Pinon

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1 Claude Husson, Pascal Frey, Jean Pinon
INRA Nancy Unité de recherche Pathologie Forestière Deux méthodes de diagnostic moléculaire des espèces de Melampsora, agents de la rouille foliaire des peupliers Cccdddddddddff Claude Husson, Pascal Frey, Jean Pinon

2 Les peupleraies 230 000 ha 1,3% de la surface boisée
moins de ha de à ha de à ha plus de ha ha 1,3% de la surface boisée 2,2 millions m3 par an ( chêne) culture clonale : monoclonale / parcelle pauciclonale / région

3 La rouille foliaire des peupliers
Agents pathogènes : Melampsora spp. (Basidiomycètes, Urédinales) urédospores urédies Dégâts: défeuillaison intense réduction de croissance affaiblissement général Pertes économiques importantes

4 M. larici-populina, la plus fréquente et la plus agressive
En France, 3 espèces de Melampsora sont pathogènes sur les peupliers cultivés : M. larici-populina, la plus fréquente et la plus agressive Sud-Ouest Ouest Centre Nord+Est M. allii-populina, présente partout en France M. medusae, parasite de quarantaine, essentiellement dans le Sud-Ouest de la France

5 Cycle de la rouille du peuplier
urédies 1 cm hôte alternant (mélèze) hôte principal (peuplier) écidies 1 mm télies 1 cm Identification des espèces à différents stades de développement : morphologie très proche entre espèces  télien écidien morphologie distincte entre espèces détection d’une espèce rare en mélange avec une espèce majoritaire urédien 

6 Origine géographique des isolats étudiés
M. medusae M. larici-populina M. allii-populina 88 isolats étudiés M. larici-populina (30 isolats) M. medusae (30 isolats) M. allii-populina (28 isolats)

7 Les deux outils de biologie moléculaire utilisés
100 pb Région ITS (Internal Transcribed Spacer) de l’ADN ribosomal ITS1 ITS2 25S 17S 5,8S ITS1 ITS4 I - Analyse de la formation d’hétéroduplex ITS1-MLP ITS1-MM ITS1-MAP ITS4-MLP ITS4-MAP ITS4-MM II - Trois couples d’amorces spécifiques des espèces : M. larici-populina M. allii-populina M. medusae

8 I - Analyse par formation d’hétéroduplex : PRINCIPE
Espèce à déterminer ITS amplifiés (amorces ITS1 / ITS4) M. larici-populina M. allii-populina M. medusae 3 ITS de référence dénaturation à 94°C renaturation jusqu’à 25°C homoduplex et hétéroduplex homoduplex

9 I - Analyse par formation d’hétéroduplex : MISE EN EVIDENCE
Révélation sur gel d’acrylamide à 8% 700 pb M MLP + MAP MM M : marqueur de taille (100 pb) MLP : M. larici-populina MAP : M. allii-populina MM : M. medusae hétéroduplex   homoduplex Révélation sur gel d’agarose à 1% M MLP + MAP MM hétéroduplex homoduplex 

10 I - Analyse par formation d’hétéroduplex
RESULTATS : Confrontations des ITS amplifiés des urédospores des 88 isolats avec les 3 ITS de référence Formation d’hétéroduplex dans 100% des confrontations interspécifiques (ITS hétérologues)  Absence d’hétéroduplex dans 100% des confrontations intraspécifiques (ITS homologues) méthode moléculaire simple et fiable pour l’identification des espèces CONCLUSIONS : gel d’agarose bien adapté au diagnostic interspécifique en routine méthode indirecte d’analyse du polymorphisme de séquence pourcentage d’homologie intraspécifique des ITS supérieur à 95%

11 II - Amorces spécifiques d’espèces : RESULTATS ET CONCLUSIONS
ITS1-MM / ITS4-MM ITS1 / ITS4 ITS1-MLP / ITS4-MLP M. larici- populina M. allii- M. medusae M 1 2 3 8 9 T 4 5 6 7 ITS1-MAP / ITS4-MAP Les couples d’amorces spécifiques d’espèce permettent l’amplification de l’ADN de 100% des isolats de l’espèce correspondante Validation sur l’ADN d’urédospores de 88 isolats : Aucune réaction croisée entre ces 3 espèces n’a été observée La spécificité des amorces est confirmée Outil d’identification des 3 espèces de Melampsora très fiable

12 1- identification d’une espèce à différents stades du développement
II - Amorces spécifiques d’espèces : APPLICATIONS 1- identification d’une espèce à différents stades du développement cas de M. larici-populina : télies sur peuplier écidies sur mélèze Validation du couple d’amorces sur ces deux stades Pas de réaction croisée avec l’ADN de l’hôte

13 II - Amorces spécifiques d’espèces : APPLICATIONS
2 - détection d’une espèce rare en mélange avec une espèce majoritaire au stade urédien (peuplier) : cas de M. medusae en mélange avec M. larici-populina M. medusae - parasite de quarantaine - espèce peu fréquente - répartition géographique mal expliquée : Sud-Ouest de la France M. larici-populina - espèce très majoritaire en France

14 2- détection d’une espèce rare en mélange dans une espèce majoritaire
II - Amorces spécifiques d’espèces : APPLICATIONS 2- détection d’une espèce rare en mélange dans une espèce majoritaire Mélanges d’ADN de M. medusae et de M. larici-populina (10 ng/µl) utilisation des amorces spécifiques de M. medusae 600 pb  M 10 ng/µl 0,1 pg/µl 0,5 1 0,05 T [ ADN M. medusae ]  Détection de M. medusae dans une solution à 0,1 pg / µl   Seuil de détection de 1 / soit l’équivalent de la quantité d’ADN de 6 urédospores dans le mélange

15 II - Amorces spécifiques d’espèces : APPLICATIONS
2- détection d’une espèce rare en mélange dans une espèce majoritaire Mélanges de SPORES de M. medusae et de M. larici-populina (extraction de 2 mg de chaque mélange = spores) 600 pb  64000 3 6 64 640 6400 Nombre de spores de M. medusae Dilution en cascade  Détection de 6 urédospores de M. medusae parmi urédospores de M. larici-populina   Seuil de détection inférieur à 1 /  Possibilité de détecter une seule urédie de M. medusae sur feuilles de peuplier très infectées par M. larici-populina

16 CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES
Les amorces spécifiques d’espèces ont montré leur efficacité :  pour l’identification de l’espèce quel que soit le stade de développement  identification des espèces sur écidies : efficacité du passage de M. larici-populina sur mélèze  la détection d’une espèce rare (amorces >>>> microscope)  application pour le contrôle du parasite de quarantaine M. medusae, effectué par le LNPV Construction d’amorces spécifiques des 5 espèces de Melampsora des trembles :  certaines ont pour hôte altenant le mélèze  l’identification au microscope est très difficile, même au stade urédien