I) Obtention de l’ADN recombinant

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1 I) Obtention de l’ADN recombinant
VECTEUR (fragment d'ADN capable de réplication autonome) ORGANISME DONNEUR : Extraction d'un fragment d'ADN d'intérêt Insertion du fragment d'intérêt dans le vecteur Obtention d'un ADN Recombinant 5 ) Amplification de l’ADN recombinant obtenu

2 5 ) Amplification de l’ADN recombinant obtenu : Transformation des bactéries
2) Choc thermique à 42°C : les plasmides vont pénétrer dans les bactéries 3) Ajout de milieu nutritif aux bactéries, croissance 1h à 37°C (cela permet l'expression des protéines de résistance aux antibiotiques pour la sélection ultérieure) 4) Étalement sur boîte (pour la sélection) 1) Mélange de plasmides et de bactéries compétentes sur glace (les bactéries compétentes ont été traitées pour faciliter l'entrée d'ADN : leur paroi a été fragilisée par un traitement au chlorure de calcium) (utilisation de Escherichia coli en général : utilisation facile, croissance rapide) Une fois les bactéries au contact de la solution de plasmides à intégrer, la mb plasmique est momentanément perméabilisée (formation de micropores) par choc thermique ou choc électrique (électroporation)

3 5 ) Amplification de l’ADN recombinant obtenu : Sélection des bactéries transformées
Il faut sélectionner les bactéries transformées (celles comportant le plasmide recombiné) Étalement des bactéries sur une boîte contenant un milieu gélosé et un antibiotique : seules les bactéries transformées pourront se multiplier car le plasmide porte un gène de résistance contre l'antibiotique Colonie de bactéries transformées Chaque colonie = ensemble de bactéries identiques provenant de la division d'une bactérie. Maintien du plasmide // pression de sélection due à l'antibiotique Mélange de bactéries transformées contenant le plasmide d'intérêt et de bactéries non transformées

4 5 ) Amplification de l’ADN recombinant obtenu : Extraction du plasmide recombiné
Ensemencement d’une colonie de bactéries transformées dans du milieu liquide + antibiotique une nuit à 37°C => Multiplication des bactéries et donc amplification du nombre de plasmides recombinés (cf. présence d'une origine de réplication bactérienne sur le plasmide, l'antibiotique assure une pression de sélection pour que les bactéries conservent le plasmide) Il faut ensuite récupérer le plasmide

5 5 ) Amplification de l’ADN recombinant obtenu : Extraction du plasmide recombiné
Les bactéries sont lysées par un détergent en milieu alcalin afin de libérer l'ADN génomique et plasmidique. L'ADN génomique et les protéines sont précipités par de l'acétate de sodium. Le précipité est séparé par centrifugation, le surnageant contient l'ADN plasmidique. L'ADN plasmidique est alors précipité (volume double d'éthanol ou isopropanol), lavé puis redissous dans un tampon adéquat. Cette étape peut être réalisée avec des colonnes de purification d’ADN.

6 I) Obtention de l’ADN recombinant
VECTEUR (fragment d'ADN capable de réplication autonome) ORGANISME DONNEUR : Extraction d'un fragment d'ADN d'intérêt Les bactéries poussant sur le milieu+antibiotique possèdent un plasmide avec le gène de résistance à l’antibiotique. Mais ce plasmide contient-il l’insert cloné ? Il peut y avoir religation du vecteur sur lui-même. Nécessité d’un crible pour trouver les clones positifs ayant intégré l’ADN à cloner. Insertion du fragment d'intérêt dans le vecteur Obtention d'un ADN Recombinant amplifié 6 ) Vérification de la construction

7 6 ) Vérification de la construction a) Vérification rapide par PCR
Les bactéries transformées peuvent contenir le plasmide recombiné (contenant l'ADN qui nous intéresse) (1) ou le vecteur refermé sur lui-même (2) => il faut distinguer ces deux populations 2 1 PCR avec les amorces ayant servi à l'obtention de l'insert, observation des produits formés sur gel d'agarose

8 6 ) Vérification de la construction a) Vérification rapide par PCR
Les bactéries transformées peuvent contenir le plasmide recombiné (contenant l'ADN qui nous intéresse) (1) ou le vecteur refermé sur lui-même (2) => il faut distinguer ces deux populations (1) (2) PCR avec les amorces ayant servi à l'obtention de l'insert, observation des produits formés sur gel d'agarose : Résultats du gel d’agarose : Aucun produit détecté pour le vecteur seul (2), mais un produit visible pour le plasmide recombiné (1)

9 6 ) Vérification de la construction b) Vérification rapide par restriction
Digestion enzymatique par une enzyme avec un site présent dans l'insert et un seul site dans le vecteur : 2 1 (ex : MscI)

10 6 ) Vérification de la construction b) Vérification rapide par restriction
(1) (2) Digestion enzymatique par une enzyme avec un site présent dans l'insert et un seul site dans le vecteur puis Analyse des produits de restriction sur gel d'agarose On obtient des cartes de restriction différentes : une seule coupure et donc une seule bande pour le vecteur seul (2), deux coupures et donc deux bandes pour le plasmide recombiné (1)

11 ADN de séquence inconnue, à séquencer
6 ) Vérification de la construction c) Vérification par séquençage : Principe de la méthode de Sanger Choix d'une amorce Synthèse du brin complémentaire par une ADN polymérase La synthèse du brin complémentaire est faite en présence de nucléotides désoxyribose, Désoxyribose : formation possible d'une liaison phosphoester (élongation de la chaîne synthétisée) P nucléotide 5’-P-polynucléotide ADN de séquence inconnue, à séquencer ADN de séquence connue Didésoxyribose : formation d'une liaison phosphoester impossible, blocage de l'élongation de la chaîne synthétisée P nucléotide Et de nucléotides didésoxyribose. 5’-P-polynucléotide

12 6 ) Vérification de la construction c) Vérification par séquençage : Principe de la méthode de Sanger Réaction de synthèse du brin complémentaire de l'ADN à séquencer à partir d'une amorce, et en présence de nucléotides et d'un didésoxynucléotide => formation de fragments de différentes tailles, dont la synthèse est bloquée au niveau du didésoxynucléotide intégré : ADN à séquencer 3' A-T-A-G-C-A-T-T-A-A-G-C-G-A 5' amorce ddT T-A-ddT T-A-T-C-G-ddT T-A-T-C-G-T-A-A-ddT T-A-T-C-G-T-A-A-T-ddT T-A-T-C-G-T-A-A-T-T-C-G-C-ddT 5' Brins formés en présence de didésoxy-thymine (ddT) dans le milieu réactionnel

13 6 ) Vérification de la construction c) Vérification par séquençage : Principe de la méthode de Sanger Les didésoxynucléotides sont marqués : radioactivité ou fluorescence. Analyse des différents brins formés sur gel ultra-résolutif (détection d'une différence d'un nucléotide) 6 5' ddT T-A-ddT 2 T-A-T-C-G-ddT T-A-T-C-G-T-A-A-ddT 4 T-A-T-C-G-T-A-A-T-ddT 5 T-A-T-C-G-T-A-A-T-T-C-G-C-ddT 6 5 5' 4 5' 3 5' 5' 2 5' 1

14 6 ) Vérification de la construction c) Vérification par séquençage : Principe de la méthode de Sanger ADN à séquencer : 3' A-T-A-G-C-A-T-T-A-A-G-C-G-A Lecture du brin complémentaire : ddT ddA ddG ddC 5' T-A-T-C-G-T-A-A-T-T-C-G-C-T Une réaction de synthèse différente pour chacun des didésoxynucléotides, analyse sur gel pour chaque réaction, lecture du brin complémentaire (en partant des plus petits fragments vers les plus gros) 4 3 2 1

15 6 ) Vérification de la construction c) Vérification par séquençage : Automatisation du séquençage
ADN à séquencer : 3'C-A-G-A-A-T-T-G-C-A-G-A-G-T Lecture du brin complémentaire : 5'G-T-C-T-T-A-A-C-G-T-C-T-C-A Automatisation des résultats de séquençage : les didésoxynucléotides sont marqués avec des fluorescences différentes, cela permet de faire une seule réaction et une seule lecture. Le séquenceur détecte la fluorescence et repère la taille des fragments d'ADN. On obtient des courbes de fluorescences qui sont interprétées en terme de nucléotides avec un indice de confiance (ici barre verte : confiance maximum)