1° - Les techniques de quantification virale

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1 LES TECHNIQUES DE BIOLOGIE MOLECULAIRE APPLIQUEES AUX HEPATITES VIRALES

2 1° - Les techniques de quantification virale
Cible ARN ou ADN Virus TMA Copies (ARN) Ajouter primers et enzymes 1 sonde de détection par copie Ajouter primers et enzymes PCR Copies (ADN) 1 sonde de détection par copie amplifiée bDNA Plusieurs sondes de détection par cible Ajouter sondes et ADN branché Détection en point final Détection en temps réel

3 Avantages et inconvénients
TMA: Avantages et inconvénients Avantages: Amplification d’ADN ou d’ARN Permet l’amplification simultanée de plusieurs cibles Production d’amplicons ARN Réalisée dans un tube unique Jusqu’à 100 résultats obtenus en 4 heures Inconvénients: Technique en grande partie manuelle sensibilité / contaminations

4 Sondes* marquées hybridées à l’Amplificateur*
bDNA Pré-amplificateur* Microplaque ARN cible Label Extender* (LE) Capture Extender (CE) Sonde de Capture Sondes* marquées hybridées à l’Amplificateur* Versant HCV-RNA (bDNA3.0)

5 bDNA 17 sondes de capture permettant une quantification
3’UT 5’UT C E1 E2/NS NS2 NS3 NS4 NS5 Structural Non-Structural HCV RNA Spacer (SP) Capture Extender (CE) Label Extender (LE) 17 sondes de capture permettant une quantification Équivalente de tous les génotypes Versant HCV-RNA (bDNA3.0)

6 bDNA Versant HCV RNA Caractéristiques bDNA 5 Standards
Gamme d’étalonnage externe Phage recombinant Contrôles 1 Positif Fort 1 Positif faible 1 Négatif (simple) Linéarité 3.200 – copies/ml 615 – 7,7.106 UI/ml Type Échantillon Plasma ou sérum Volume échantillon 50 µl Instrumentation Système 340 ou 440

7 bDNA Avantages Inconvénients Technique automatisée
Excellente reproductibilité Permet la quantification de l’ARN VHC avec une bonne linéarité prise d’essai faible : 50 μl Inconvénients 84 résultats peuvent être rendus après 2 demi-journées sur 2 jours de manipulation séries minimum de 24 échantillons Sensibilité relativement faible : seuil de détection à 615 UI/l

8 PCR en point final Amplicor Roche ou LCx Abbott
Détection colorimétrique ou fluorimétrique en point final

9 PCR en point final Amplicor HCV 2.0 Roche Abbott LCx Hépatite C
Linéarité :600 à UI/ml Sensibilité 50 UI/ml en qualitatif, 600 en Monitor Abbott LCx Linéarité jusqu’à 23 millions IU/ml Sensibilité 23 UI/ml

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11 PCR en temps réel

12 PCR en temps réel Gamme de linéarité
Dans le cas d’une PCR classique, en point final, que l’on arrête à 25 cycles. Ici au niveau de la flèche. Il apparaît que seuls 3 à 4 produits de la PCR (cinétiques, ou échantillons) sont à la phase exponentielle de la PCR, les autres sont soit déjà au plateau de la PCR soit ne sont pas encore en phase exponentielle. Donc lorsque l’on travaille en PCR classique on ne peut travailler que sur 3 à 4 log de dilution d’échantillon (1000 à ). Par contre lorsque l’on travaille en PCR en temps réel, on a accès à la cinétique de la PCR, pour l’ensemble des échantillons. Comme on peut l’observer dans cette figure, on a donc accès à 10 log de linéarité de la PCR voire même plus. Le gros avantage donc de la technologie de PCR en temps réel pour le laboratoire de diagnostic c’est de pouvoir travailler sur tous les échantillons sans pré-dilution de ceux-ci.

13 PCR en temps réel Ct Log C0 108 copies 10 copies Droite standard

14 PCR en temps réel SYBR® Green Sondes d’hybridation MGB TaqMan ®
Principaux types de fluorophores SYBR® Green TaqMan ® Sondes d’hybridation MGB TaqMan ® Molecular beacon, Scorpions...

15 PCR en temps réel Principe du FRET : Fluorescence resonance Energy Transfert λ d’excitation Transfert d’énergie sans transfert de photons (non radiatif)

16 PCR en temps réel Technologie TaqMan® quencher reporter
Une sonde spécifique du gène cible à quantifier (composée du rapporteur et du quencheur) se fixe sur la séquence cible. L’émission de fluorescence du rapporteur est bloquée par le quencher. La polymérase dégrade la liaison rapporteur-quencher La libération du quencher permet l’émission de fluorescence à partir du rapporteur. La quantité de fluorescence émise par le rapporteur est proportionnelle à la quantité du produit PCR synthétisé. A chaque cycle de PCR, on mesure la quantité de fluorescence émise et au bout de 40 cycles de PCR on obtient ainsi une cinétique de PCR comme montré dans la diapositive suivante.

17 PCR en temps réel Technologie FRET par sondes spécifiques

18 Cobas TaqMan 48 Abbott Real Time
Chargement des tubes primaires Extraction automatisée cobas AmpliPrep Extraction 1h30 Une fois les échantillons extraits (manuellement, ici dans un 1er temps) , ils sont additionnés au mix PCR, qui contient les sondes taqman, primers etc nécessaires à la détection en PCR en temps réel. Le temps de manipulation sur le temps total est de maximum 1h30 sur les 5h totales Préparation de la réaction de PCR 15mn CTM 48 et AL 3.1 station de pilotage Amplification et Détection 3h

19 Acides nucléiques totaux ARN et ADN Technologie de capture sur billes de silice
Lyse, stabilisation et déprotéinisation Libération des acides Nucléiques à partir des billes Elution 80°C Capture Lavage TA Fixation des Acides nucléiques sur la silice à la surface des Magnetic Particle (Billes) Casse des Virus et des cellules Libération des acides nucléiques Cible ADN ou Cible ARN (Virus) Particle Magnetic (Billes) coatées à la silice Virus ou Cellule 37°C

20 PCR en temps réel Les avantages Une grande sensibilité
Une gamme très étendue de linéarité Détection simultanée de plusieurs cibles (standard interne de quantification) Possibilité de Multiplex Les avantages de la PCR en temps réel sont liés à la mesure de la fluorescence pendant la phase exponentielle. Ainsi on va obtenir une grande sensibilité associée à une gamme de linéarité exceptionnelle (plusieurs centaines de millions de copies/ml (ou UI/ml) pour certains paramètres. La possibilité de faire de la quantification en multiplex avec un standard interne de quantification. Inconvénients Prise d’essai importante d’environ 1ml Appareillage spécifique

21 Roche Cobas AmpliPrep/ TaqMan 48 HCV
PCR en temps réel L’hépatite C Abbott Real Time HCV Roche Cobas AmpliPrep/ TaqMan 48 HCV CAP/CTM TaqMan HCV : Linéarité : 43 UI/ml à 69 millions UI/ml Sensibilité : 15 UI/ml Spécificité : 99,99% Génotype : 1 à 6 ? : sous-estimation des génotypes 4 ART HCV : Linéarité : 12 UI/ml à 50 millions UI/ml Sensibilité : 12 UI/ml Spécificité : >99% Génotype : 1 à 6 : pas de dépendance au génotype Les régions détectées par le test HIV-1 Cobas Taqman sont les mêmes que celles détectées dans le test CA HIV Monitor.

22 Roche Cobas AmpliPrep/ TaqMan 48 HCV
PCR en temps réel L’hépatite B Roche Cobas AmpliPrep/ TaqMan 48 HCV Abbott Real Time HCV CAP/CTM TaqMan HBV: Linéarité : millions UI/ml Sensibilité : 12 UI/ml Spécificité : 99,50% Génotype : A à G, mutants pré-core ART HBV : Linéarité : 1.16 log c/ml à 9.16 log c/ml Sensibilité : 10 UI/ml Spécificité : 100% Génotype : A, B, C, D, E, F, G et H détectés En ce qui concerne le test CTM 48-HBV , il améliore la sensibilité des test existants et pulvérise la linéarité.

23 2° - Les techniques de détection des génotypes et des mutants
Cible ARN ou ADN Virus LIPA SEQUENCAGE Chromogène (NBT/BCIP) Précipité Violet

24 VERSANT HCV LiPA 2.0 Chromogène (NBT/BCIP) Précipité Violet

25 VERSANT HCV LiPA 2.0 5’ UT Region Core Region
3 18 17 15 19 20 21 23. AC Marker CC AC 4 8 7 5 6 9 10 11 12 13 14 a b c-l 16 2b 3a 4b 6a 1b 7-9 1a Band positions HCV RNA regions 5’ UT Core E 1 E 2 NS2 NS3 NS4 NS5A NS5B 3’ UT Core Region 23 Amp Control 24 6 c-l 25 1a 26 1b 5’ UT Region Same band configuration as current LiPA

26 VERSANT HCV LiPA 2.0 Extension du menu de génotypage GT 1à 6 c-l
5’NCR GT 1-6 Core GT 1a/1b et GT 6 c-l Amélioration du soustypage Meilleure Spécificité entre 1a et 1b Nouveau design des bandelettes Toujours 1 bandelette /1 résultat Marqué CE Une boite d’amplification comprenant tous les réactifs nécessaires Plusieurs méthodes d’extraction testées et validées

27 TRUGENETM HCV 5 ’NC (Type/Soustype/Isolat/accession number)
TRUGENE HCV 5’NC Autres protocoles Amplicor HCV Monitor - Purification CLIP™ Sequencing / TRUGENETM HCV 5 ’NC Long-Read Tower™ GeneObjects™ Gene Objects™ / GeneLibrarian™ Rapport de génotypage TRUGENETM HCV 5 ’NC (Type/Soustype/Isolat/accession number) Détection du séquençage Analyse de séquence Preparation échantillons Réaction de 3h 0h 5 ’NC Amplicon

28 TRUGENE HCV 5’NC

29 Génotypage HCV LIPA TRUGENE
Avantages et inconvénients des deux techniques LIPA Possibilité de grandes séries avec détection automatisable Détection des doubles populations Lipa 1 sur amplicons Roche mais Lipa 1 : mauvaise discrimination des sous-types 1, pas de 6 Lipa 2 : mise en œuvre nécessitant une amplification spécifique TRUGENE ++ pour épidémiologie (comparaison de souches) Meilleure discrimination des sous-types mais Petites séries uniquement Difficulté de mee de doubles populations

30 Mutants HBV : rappels Génome du virus B Mutants précore :
Sur le gène précore mutation stop entraînant l’arrêt de la synthèse de l’Ag Hbe Sur le BCP (binding core promoter) qui agit sur la régulation du gène core Mutants YMDD : Sur le gène de la polymérase, site d’action des analogues nucléosidiques (lamivudine)

31 Mutants HBV : rappels Mutants précore : Mutants de la polymérase :
Interêt de leur détection Mutants précore : Lien avec l’évolution de la maladie ? Lien avec la réponse au traitement ? Mutants de la polymérase : Adaptation du ou des traitements : Apparition quasi systématique en cas de tt prolongé à la lamivudine seule Certaines mutations pourraient compromettre les traitements ultérieurs par d’autres molécules Arrêt du tt (sans risque) ou changement de molécule

32 TRUGENE HBV GENOTYPING
Même technologie que pour l’HCV Intérêt clinique : différences de pronostic d’évolution spontanée et sous traitement des génotypes : Occident : A > D (plus sensible à l’interféron) (Erhardt et al, Gut,2005, 54 : ) Asie : B >C (moins d’activité inflammatoire et d’évolution vers la cirrhose; meilleure réponse au tt)

33 TRUGENETM HBV assay ~500pb 101 237 110 279 preS1 preS2 HBsAg TP SPACER
SA Mutations* 145R preS preS2 HBsAg TP SPACER RT RNase H F A B C D E RT Mutations** 173L 180M/V 204I/V (YMDD) 207I 236T*** I169T, M250V**** T184S/A and S202G**** 110 279 Lamivudine Adefovir Entecavir * Carman et al The Lancet, 336, ** Pillay et al International Antiviral News, 6:9 *** Angus et al Gastroenterology, 125, **** Colonno et al, 2005 EASL, Abstract 478

34 TRUGENE HBV TRUGENE™ HBV Report Préparation de l’échantillon
Extraction de l’ADN génomique Qiagen Blood DNA Extraction Kit PCR Réaction PCR 1.2 kb fragment Réaction de séquençage Sequencing Reaction CLIP sequencing (520 pb) Détection des séquences Long-Read Tower ™ GeneObjects ™ GO 3.2 Analyse des séquences GeneObjects ™ / GeneLibrarian ™ Mutations Genotype (A to G) TRUGENE™ HBV Report

35 GeneLibrarian™ HBV Module:
Genotyping report (1): Genotype séquence consensus la plus proche HBV genotype

36 GeneLibrarian™ HBV Module:
Genotyping report (2) : Mutation Profile List of Mutations in SA and Pol (RT) Published substitutions Silent mutations (all positions) Substitution not at published sites Unpublished coding changes

37 DETECTION DES MUTANTS HBV
technique LIPA par Innogenetics Mutants précore Mutants YMDD

38 Mutants et génotypes HBV
Comparaison des deux techniques Format Genotype viral (A-G) Mutations RT Mutations Ag HBs Nouvelles Mutations sur RT & SA TRUGENE HBV automatisé, facile à interpréter, standardisé OUI LIPA Manuel, facile à mettre en oeuvre, pas d’appareillage Non OUI

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40 Remerciements à Catherine Lemagne, société Bayer
Nicolas Gautier, société Roche Christine Murigneux, société Abbott pour l’aide apportée dans l’iconographie