Outils chimiques pour l’étude des macromolécules biologiques

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1 Outils chimiques pour l’étude des macromolécules biologiques
Marius Réglier Laboratoire de Bioinorganique Structurale, service 432 Chimie, Biologie et Radicaux Libres UMR-CNRS 6517 Université Paul Cézanne Aix-Marseille III Faculté des Sciences et techniques Avenue Escadrille Normandie-Niemen 13397 Marseille cedex 20

2 I. L’apport de la chimie à la biologie moléculaire

3 Le 25 avril 1953, Crick et Watson révèlent la structure de l'ADN
Erwin Chargaff Rosalind Franklin Prix Nobel de Medecine en 1962 F. Crick, J. Watson et M. Wilkins

4 Le dogme transcription tRNA traduction DNA mRNA protéine réplication

5 L’ADN, deux paires de bases AT, CG

6 Triplex

7

8 Quadruplex Télomères

9 ADN, deux brins 3’ 5’ T C G A

10 DNA, double hélice

11 DNA, polymorphisme Forme B, forme commune dans les conditions physiologiques, faible force ionique et haut dégré d’hydratation (10 paires de bases/tour avec une conformation C2'-endo/anti), deux sillons distincs. Forme Z, (Zigzag) riche en paires G-C, allongée et étroite, possède une unusuelle hélice gauche (12 paires de bases/tour), un seul sillon compact Le Zigzag résulte d’une alternance de purines (C3'-endo/syn) et de pyrimidines (C2'-endo/anti). Forme A-form, aux fortes concentrations en cations ou aux faibles degrés d’hydratation (11 paires de bases/tour, C3'-endo/anti), 2 sillons (1 grand étroit et profond et 1 petit large et peu profond).

12 DNA, polymorphisme

13

14 DNA, packaging nucléosomes Chromosome chromatine

15

16 Réplication

17 Transcription et traduction

18 ARN, deux paires de bases AU, CG
ADN ARN

19 ARN, monobrin 3’ 5’ U C G A

20 ARNt

21 Anti-codon

22 Le code universel 43 (64) codons pour 20 amino-acides
TTT  F Phe      TCT  S Ser      TAT  Y Tyr      TGT  C Cys TTC  F Phe      TCC  S Ser      TAC  Y Tyr      TGC  C Cys TTA  L Leu      TCA  S Ser      TAA  * Ter      TGA  * Ter TTG  L Leu i    TCG  S Ser      TAG  * Ter      TGG  W Trp CTT  L Leu      CCT  P Pro      CAT  H His      CGT  R Arg CTC  L Leu      CCC  P Pro      CAC  H His      CGC  R Arg CTA  L Leu      CCA  P Pro      CAA  Q Gln      CGA  R Arg CTG  L Leu i    CCG  P Pro      CAG  Q Gln      CGG  R Arg ATT  I Ile      ACT  T Thr      AAT  N Asn      AGT  S Ser ATC  I Ile      ACC  T Thr      AAC  N Asn      AGC  S Ser ATA  I Ile      ACA  T Thr      AAA  K Lys      AGA  R Arg ATG  M Met i   ACG  T Thr      AAG  K Lys      AGG  R Arg GTT  V Val      GCT  A Ala      GAT  D Asp      GGT  G Gly GTC  V Val      GCC  A Ala      GAC  D Asp      GGC  G Gly GTA  V Val      GCA  A Ala      GAA  E Glu      GGA  G Gly GTG  V Val      GCG  A Ala      GAG  E Glu      GGG  G Gly

23 Polymerase Chain Reaction (PCR)

24 Polymerase Chain Reaction (PCR)
5’---AACGTC TGCATT---3’ 3’---TTGCAG ACGTAA---5’ 5’--ACGTAA---3’ + 5’---AACGTC--3’ + dNTP + TaqPol  --ACGTAA---5’ 5’---AACGTC-- 3’--ACGTAA---5’ + 5’---AACGTC--3’ dNTP + TaqPol

25 Polymerase Chain Reaction (PCR)
5’---AACGTC TGCATT---3’ 3’---TTGCAG ACGTAA---5’  5’---AACGTC TGCATT---3’ 3’---TTGCAG ACGTAA---5’ + 3’--ACGTAA---5’ + 5’---AACGTC--3’ 5’---AACGTC TGCATT---3’ --ACGTAA---5’ 5’---AACGTC-- 3’---TTGCAG ACGTAA---5’ + dNTP + TaqPol 5’---AACGTC TGCATT---3’ 3’---TTGCAG ACGTAA---5’ + 30 cycles permettent d’amplifier 2 brins d’ADN en exemplaires.

26 Plasmide

27 Enzyme de restriction (EcoRI) CAATTG

28 I.1. Synthèse des oligonucléotides

29 Synthèse des oligonucléotides en phase supportée
la synthèse chimique des oligonucléotides se fait de 3' vers 5'.

30 Les dérivés phosphoramidites des 4 nucléotides

31 Etape 1: de-blocking

32 Etape 2: Condensation

33 Etape 3: Capping

34 Capping -----ATGCTACGTCAACTA----- Sans -----ATGCTAC -----ATGCTA -----ATGCTACG -----ATGCTAG -----ATGCTAC -----ATGCTACGT -----ATGCTAGT -----ATGCTACT -----ATGCTAG Avec -----ATGCTACGTCAACTA----- -----ATGCTACGTCAACT -----ATGCTACGTCAAC -----ATGCTACGTCAA -----ATGCTACGTCA -----ATGCTACGTC -----ATGCTACGT -----ATGCTACG

35 Etape 4: Oxydation

36 Etape finale

37 Synthétiseur

38 I.2. Séquençage de l’ADN

39

40 La méthode de Maxam and Gilbert
5’ ATGCTACGTCAACTA ’ 3’ TACGATGCAGTTGAT ’ Enzyme de restriction (EcoRI) Introduction dans un plasmide 5’-----ATGCTACGTCAACTA-----3’ 3’-----TACGATGCAGTTGAT-----5’ Primer ADN polymérase dATP, dTTP, dCTP et dGTP  dATP radioactif P32

41 La méthode de Maxam and Gilbert
5’-----ATGCTACGTCAACTA-----3’ Tube 2 + Me2SO4-0.1M HCl 3’---TACGATGCAGTTG 3’---TACGATGCAGTT 3’---TACGATGCA 3’---TACGATGC 3’---TACGAT 3’---TACG 3’---TAC 3’---T A + G Tube 1 + Me2SO4-0.1M NaOH G Tube 3 + N2H4 3’---TACGATGCAGTTGA 3’---TACGATGCAGT 3’---TACGATGCAG 3’---TACGATG 3’---TACGA 3’---TA 3’--- C + T Tube 4+ N2H4-NaCl C

42 La méthode de Maxam and Gilbert
A+G T+C C A AT ATG ATGC ATGCT Migration ATGCTA Lecture ATGCTAC ATGCTACG ATGCTACGT ATGCTACGTC ATGCTACGTCA ATGCTACGTCAA ATGCTACGTCAAC ATGCTACGTCAACT ATGCTACGTCAACTA

43 Séquençage de l’ADN : la méthode de Sanger

44 Séquençage de l’ADN : la méthode de Sanger
Primer ADN polymérase dATP, dTTP, dCTP et dGTP  dATP radioactif P32 5’-----ATGCTACGTCAACTA-----3’ 3’-----TACGATGCAGTTGAT-----5’ Tube 1 + ddTTP -----ATGCTACGTCAACTA----- -----TACCATGCAGTTGAT -----TACCATGCAGTT -----TACCATGCAGT -----TACCAT -----T Tube 2 + ddCTP -----ATGCTACGTCAACTA----- -----TACCATGC -----TACC -----TAC Tube 4+ ddATP -----ATGCTACGTCAACTA----- -----TACCATGCAGTTGA -----TACCATGCA -----TACCA -----TA Tube 3 + ddGTP -----ATGCTACGTCAACTA----- -----TACCATGCAGTTG -----TACCATGCAG -----TACCATG

45 Autoradiographie du gel de séquence
ddGTP ddATP ddTTP ddCTP A C G T A AT ATG ATGC ATGCT Migration ATGCTA Lecture ATGCTAC ATGCTACG ATGCTACGT ATGCTACGTC ATGCTACGTCA ATGCTACGTCAA ATGCTACGTCAAC ATGCTACGTCAACT ATGCTACGTCAACTA

46 Fluorescence (Diagramme de Jablonski )
Energie S1 hn hn S0 FAM max = nm Emmax = nm

47 Pigments

48 Marquage fluorescent Dye-labeled primer sequencing
colorant attaché en 5’ du primer 2) Internal labeling colorant attaché à un dNTP et incorporé durant la synthèse du nouveau brin d’ADN 3) dye-labeling terminator sequencing colorants attaché à un ddNTP

49 Point d’ancrage du pigment

50 Dye-labeled primer sequencing
5’-----ATGCTACGTCAACTA-----3’ 3’-----TACGATGCAGTTGAT-----5’ Primer ADN polymérase dATP, dTTP, dCTP et dGTP Tube 1 + ddTTP -----ATGCTACGTCAACTA----- ----TACCATGCAGTTGAT ----TACCATGCAGTT ----TACCATGCAGT ----TACCAT ----T Tube 2 + ddCTP -----ATGCTACGTCAACTA----- ----TACCATGC ----TACC ----TAC Tube 4+ ddATP -----ATGCTACGTCAACTA----- ----TACCATGCAGTTGA ----TACCATGCA ----TACCA ----TA Tube 3 + ddGTP -----ATGCTACGTCAACTA----- ----TACCATGCAGTTG ----TACCATGCAG ----TACCATG

51 d-Rhodamine dye-labeled terminators
ddC-EO-5dTMR ddT-EO-6dROX

52 d-Rhodamine dye-labeled terminators
ddT-PA-5dR6G ddT-EO-5dR110 PA, propargylamino - EO, propargyl ethoxyamino

53 ddT-BigDye terminator
excitation émission Transfert d’énergie

54 Gel de séquence