B.Jaklevic et al.[April 2008] Developmental biology

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1 B.Jaklevic et al.[April 2008] Developmental biology
KOPLIKU Lela EL ASRI Hanane Modulation of ionising radiation-induced apoptosis by bantam microRNA in Drosophila B.Jaklevic et al.[April 2008] Developmental biology

2 Développement de la drosophile
I-Introduction Développement de la drosophile

3 I-Introduction Biogenèse et maturation des microRNA (miRs)
MV Iorio and CM Croce (2009) J Clin Oncol 27

4 5 séquences cibles de bantam
I-Introduction Bantam microRNA (21nt) inhibe l’expression de Hid Code une protéine de 410 aa Partie N-ter de 14 aa commune = domaine RHG Profil d’expression constitutif Surexpression induit la mort( rôle pro-apoptotique) HID (head involution defective) miRNA bantam 5 séquences cibles de bantam 3’ 5’ Animation batam ARNm hid 5’ bantam a un effet anti-apototique 3’UTR

5 Apoptose : réponse clé des radiations ionisantes
I-Introduction Apoptose : réponse clé des radiations ionisantes Induction de cassures double brins de l’ADN Activation de p53 Activation de l’apoptose

6 Quel est le rôle de bantam en réponse aux radiations ionisantes?
Réponse au question dans la conclusion.il faut pas oublier de répondre ptécisément aux questions que l’on pose au départ.

7 II-Résultats a- Effets des rayons-X sur les mutants ban
Fig. 1. Les disques imaginaux d’ailes ont été disséqués à partir des larves 3.5-4h après irradiation aux rayons-X avec 0R (-IR) ou 4000R (+IR), et colorées avec l’Acridine Orange. Retirer apoptose EP:allèle hypomorphe :Délétion du locus ban Rayon X La perte de fonction de ban induit l’augmentation de l’apoptose spontanée (-IR) et induite (+IR)

8 II-Résultats EGFP bantam sensor
transgène constitué du promoteur de tubuline, de la séquence codante de l’EGFP fusionnée à deux copies de la séquence cible de ban en 3’UTR (appelé ‘bantam sensor’) bantam sensor(3’UTR) Une diminution du signal EGFP reflète une augmentation de l’activité du répresseur ban. b- Effets des rayons-X sur l’activation de ban Promoteur tubuline EGFP Faire un schéma du transgène pour que la compréhension soit plussimple je pourrai le faire si tu ve

9 II-Résultats b- Effets des rayons-X sur l’activation de ban Fig. 2
3ème stade larvaire La fluorescence de l’EGFP a été analysés dans les disques imaginaux d’ailes après 5,18 ou 24 h d’irradiation avec 0 ou 4000 R Rayon X larves au troisième stade larvaire, ont été analysés pour la fluorescence d’EGFP à 5, 18 ou 24 h après exposition aux rayons-X à 0 ou 4000 R. EGFP ban sensor diminue au cours du temps Augmentation de l’activité de ban au cours du temps => Les radiations ionisantes induisent l’activation de ban

10 II-Résultats c- Importance de ban au niveau de l’organisme Fig. 3 Irradiation des larves après 96h+/-4h du dépot des œufs. Toutes les larves irradiés ont formés des pupes. % éclosion= pourcentage de pupes qui éclosent donnant des adultes viables. . Les larves ont été irradiés à 96+/- 4 h après déposition des œufs avec les doses de rayons-X montrés. Le pourcentage des pupes qui éclore a été quantifié 10 jours après irradiation. ban est requis pour assurer la survie de l’organisme après irradiation

11 II-Résultats p53 est requis pour l’activation de ban
d- Effets de p53 sur l’activation de ban Fig. 4. Les larves sont homozygotes pour p535A-1-4 et pour l’insertion 20.X du ‘ban sensor’. (A, B) La fluorescence d’EGF a été analysée 24 h après irradiation dans les disques imaginaux d’ailes . (D) Le niveau d’EGFP a été analysé par Western blot à partir des extraits larvaires . EGFP  ban sensor   En contexte mutant p53 la quantité d’expression de « ban sensor » ne diminue pas sous l’effet des rayons X ban n’est pas activé chez les mutants p53 p53 est requis pour l’activation de ban =>

12 Effet des rayons X dans les disques imaginaux d’ailes de larves
Récapitulatif 1 Effet des rayons X dans les disques imaginaux d’ailes de larves Cassure double brins Rayon X + p53 miRNA bantam ? + EGFP Hypothèse 1: -ban sensor Après irradiation,p53 induirait l’activation de ban via l’augmentation de son niveau d’expression Faire un petit schéma pour résumer les dernieres conclusion Enlever l’encadrer survie de l’organisme

13 Quantification Northern blot
II-Résultats d- Effets de p53 sur l’activation de ban Fig. 5 Extraction de l’ARN total de larves WT (A) et homozygotes mutantes p53 (B) Analyse du niveau d’expression du miRNA ban mature. exposition des larves aux Rayons X 0(-) ou 4000 R(+) Northern blot Quantification Northern blot pas de changement significatif du niveau d’expression de ban après irradiation. Légende a ajoiuter P53 active ban sans augmenter son niveau d’expression =>

14 Effet des rayons X dans les disques imaginaux d’ailes de larves
Récapitulatif 2 Effet des rayons X dans les disques imaginaux d’ailes de larves Rayon X Cassure double brins Hypothèse 2: L’apoptose serait nécessaire à l’activation de bantam après irradiation L’’activation de p53 est nécessaire à l’activation de ban + p53 miRNA bantam p53 active l’apoptose + + apoptose On a vu que p53 est necessaire a l’activation de ban Or p53 induit l’apoptose Donc l’apoptose serait necessaire à l’activation de ban

15 Partie antérieur de l’aile
II-Résultats e- Effets de l’inhibition de l’apoptose sur l’activation de ban Fig. 6. Les disques imaginaux d’ailes des larves controles (A, B) et irradiés (C, D) ont été analysés pour la fluorescence d’EGFP (A, B) ou pour la coloration en Acridine Orange (B, D) 24h après irradiation aux rayons-X à 0 ou 4000 R. Hh-GAL4>UAS-p35:expression de p35 dans la partie postérieur du disque imaginal d’aile corrélation entre l’’absence d’apoptose et l’ inactivation de bantam Dire al’oral pour tester cette hypothèse il ont utilisé un inhibiteur de l’apotose On peut dire a l’oral sans l’ecrire que ces larves on été obtenu par croisement entre une souches exprimantl’elément p20x hh-gal4 et une souche porteuse de l’element p uas-p35(c ds la légande de la figure de l’article). Après la conclusion. C’est donc l’apoptose induit par p53 qui est necessaire a l’activation de ban.aucune contribution de p53 n’a mis en évidence p35 Contrôle: Partie antérieur de l’aile La mort cellulaire est requise pour une activation optimale de ban après irradiation.

16 Effet des rayons X dans les disques imaginaux d’ailes de larves
Récapitulatif 3 Effet des rayons X dans les disques imaginaux d’ailes de larves + p53 apoptose + miRNA bantam

17 hid est une cible importante de ban en réponse aux irradiations
II-Résultats f- Effet de l’irradiation sur la régulation de l’expression de hid par ban Fig. 7. Les disques imaginaux d’ailes contrôle (A, C) et irradiés (B, D) ont été analysés par la fluorescence EGFP 24 h après irradiation aux rayons-X avec 4000R. Les larves sont homozygotes pour le hid-3’UTR sensor (A, B; ‘hid’) ou le hid 3’UTR sensor delété pour les deux sites cibles de ban (C, D; ‘hid Δ 1,4). L’expression de hid-3’UTR sensor est réduit au niveau des disques imaginaux irradiés. ARNm EGFP 5’ 3’ L’expression de hid Δ 1,4 n’ est pas réduit au niveau des disques imaginaux irradiés. hid Δ 1,4 hid 3’UTR sensor hid est une cible importante de ban en réponse aux irradiations

18 II-Résultats g- Effet de la suppression de hid dans les mutants ban Fig. 8. Les larves ont été irradiés à 96+/- 4 h après dépôt des œufs aux rayons-X. Toutes les larves irradiés ont formés des pupes. Le pourcentage des pupes qui éclosent et donnent des adultes ,a été quantifié 10 jours après irradiation. La suppression de hid sauve les mutants ban de la sensibilité aux irradiations

19 Récapitulatif 4 + apoptose + 5’ 3’ 3’UTR p53 miRNA bantam miRNA bantam
Effet des rayons X dans les disques imaginaux d’ailes de larves + p53 apoptose + miRNA bantam miRNA bantam ARNm hid 5’ 3’ 3’UTR Inhibition de l’expression de hid Survie des larves

20 III-Conclusion Les rayons X induisent une augmentation de l’activité de ban dans les disques imaginaux et permettent la survie des cellules et des larves irradiées via l’inhibition de hid imliqué dans la voie apoptotique. Survie des celules irradié(via le freinage de l’apoptose)

21 IV-Discussion Comment ban est activé dans les cellules?
Hypothèse: les cellules apoptotiques activeraient ban de manière non-autonome cellulaire! Par quel mécanisme moléculaire est régulé l’activation de ban? L’activité de ban augmente après irradiation, alors que son niveau reste inchangé! Voie Hippo: voie suppresseur de tumeur conditions normales : |  ban Après irradiations  Modèle hypothétique Est-ce qu’il y a d’autres cibles de ban? Comment la cellule choisi entre apoptose et survie cellulaire. Hpo Yorkie p53 Hpo Niveau inchangé.(pas le cas pour les autres miARN Dans d’autre plublication anterieur il a été mis en éviedence une relation entre p53 et ban viaHippo voie suppresseur de tumeurs(Nolo et al,2006 et Thomson and cohen,2006) La cellule régule de manière differente les voies selon que la cellule soit en condition normalzes ou en condition de stress

22 Voir d’autre foto dans le magasine bio
Plusieurs voie vont contribuer soit a la mort cellulaire soit a la survie cellulaire soit a la prolifération cellulaire. Il s’installe une balance entre mort cellaire d’une et prolifération cellualire et survie d’autre part. Ban n’est pas le seul a agir sur hid. Je dis les voies. En fonction des condition de la cellule stress ou non cette balance se penchera plus vers une prolifération(facteur de croissance) fixation fcteur croissance ou penchera vers l’apoptose si la cellule et soumise a un stress(radiattion ionisante) mais des vois de survie seront activé en meme temps. Les mirna découvert que très recement en 2008( prix nobel ) ont un role très important dans la régulation de l’expressin des gènes de plusieur proccesus biologiques differents…. Ce sont des voies qui s’autoriguel se n’est pas linéaire Impotance des mirna dans la regulation des voies apoptotiques