Biotechnologie végétale

Présentation au sujet: "Biotechnologie végétale"— Transcription de la présentation:

1 Biotechnologie végétale
Cultures in vitro de plantules Suspensions cellulaires et protoplastes : Des outils pour la recherche fondamentale

2 Exemples d’utilisation en recherche fondamentale
Cultures de plantules in vitro Approches pharmacologiques et toxicologiques Suspensions cellulaires et protoplastes Échanges membranaires, mécanismes signalétiques Adressage protéique Dédifférenciation, Différenciation Contrôle du métabolisme

3 Approches pharmacologiques sur plantules
Déterminisme hormonal de la formation de racines secondaires Zhu et al.

4 Utilisation des suspensions cellulaires dans un contexte de signalisation cellulaire

5 Hypersensitive Response (HR)
Interactions plantes / pathogènes Réaction rapide À plus long terme … HR Mort cellulaire Circonscription du pathogène SAR Systemic Acquired Resistance : « Immunisation des plantes »

6 Exemple typique : infection par le virus de la mosaïque du Tabac
3 jours d’infection Lam et al. (2001) Nature Nécroses = mort cellulaire Restriction de la propagation du virus

7 Caractéristiques histologiques de la réaction hypersensible
Composés phénoliques (autofluorescence) Callose Mort cellulaire (Bleu Evans) H2O2 Ehrenfeld et al Mol. Cells

8 Inconvénients du modèle plante entière
Culture des plantes : En serre : dépendance des saisons Chambres de culture : coûteux Variabilité importante Dosages enzymatiques difficiles Problèmes de pigments Mesures de flux difficiles Utilisation difficile d’inhibiteurs

9 Utilisation de suspensions cellulaires
Quantification de la mort cellulaire Utilisation d’inhibiteurs Petites quantités Rapidité d’absorption Facilités d’extraction et dosages Métabolites (SA, phénylpropanoides ROS, NO…) Activités enzymatiques Extractions d’ARN

10 Estimation de la mort cellulaire
Colorants des cellules vivantes : Fluoresceine diacétate Rouge neutre des cellules mortes Bleu Evans, Bleu Trypan, Iodure de propidium Comptages sous microsope Comptages par fluorimétrie

11 Mort cellulaire : Nicotiana tabacum/ Phytophtora cryptogea
H2O Cryptogéine Prélèvements et comptage de la mort cellulaire au cours du traitement Cryptogéine % mortalité Témoin heures

12 Recherche d’évènements précoces
Cryptogéine % mortalité Témoin heures Que se passe-t-il pendant ces premières heures?

13 Synthèse des composés phénoliques
Transcription du gène codant la PAL H2O Cry 50 µM Zhang et al Plant Cell

14 Suivi des concentrations ioniques intracellulaires
Exemple du calcium

15 Sondes calciques

16 Pénétration des sondes
Problème : sondes chargées négativement, imperméantes Solution : dérivation avec un groupement acétométhylester (AM) Les molécules pénètrent les cellules Action d’esterases endogènes Libération des formes actives dans le cytoplasme

17 Inconvénients Sensibilité au pH :
Compartimentation ? Changements de pH cytoplasmique plus qualitatif que réellement quantitatif

18 Suivi du calcium intracellulaire
Système Nicotiana plumbaginifolia / apoaequorine

19 Mode d’action de la coelentérazine
calcium Ca2+ coelentérazine Ca2+ Ca2+ + + O2 Ca2+ + CO2 +λ=469nm Ca2+ Ca2+ apoaequorine

20 Fluctuations de la concentration cytosolique de calcium
Temps (min) Cry (0.5 mM Ca2+) Cry (0.4 mM Ca2+) Cry (0.3 mM Ca2+) Cry (0.2 mM Ca2+) Cry (0.1 mM Ca2+) 10 20 30 40 2,4 [Ca2+] cyt (µM) Lecourieux et al Plant Cell

21 Elaboration d’un modèle de signalisation cellulaire
Ca2+ Cry Mort cellulaire Phosphorylations (kinases) NO3- NADPH NADP H2O2 Modèle très simplifié d’une voie de transduction du signal entre la perception de la cryptogéine et la mort cellulaire (Nicotiana)

22 Utilisation de protoplastes en recherche
Transport membranaire Adressage protéique Protoplastes tissu-spécifiques

23 Étude de transports membranaires
Photoassimilats Minéraux, H2O Absorption racinaire Trafic vasculaire Relations Source / Puit

24 Étude de transports membranaires
Problème des suspensions cellulaires: Agrégats Paroi végétale Les protoplastes : un modèle simple et pertinent

25 Étude de transports membranaires
Traceurs isotopiques Sondes fluorescentes Electrophysiologie

26 Traceurs isotopiques Incubation protoplastes + 63Ni 10 µM
Filtration et rinçage CaCl2 2 mM s Ni Ca Ni Ca Ca Ni Ni Ca Ni Ni Filtre 0.45µM Ni 5 mn Ni Comptage 63Ni dans le filtre = Ni intracellulaire

27 Sondes fluorescentes Protoplastes de blé chargés avec du BTC-5N (spécifique du Cd) Lindberg et al. (2004) Planta

28 Utilisation des protoplastes en électrophysiologie

29 Caractérisation de canaux voltage- dépendants
Les solutés diffusent selon le gradient électrochimique. Comment caractériser la régulation électrique de canaux ? Voltage Clamp Patch Clamp

30 Voltage Clamp Une électrode enregistre les modifications de tensions
La seconde impose une tension et corrige les variations Protoplaste Enregistrement des courants ioniques

31 Patch Clamp Mesure des courants sur une surface membranaire très réduite forte résistance : mesure de courants faibles étude d’un petit nombre de canaux

32 Patch Clamp : principes
Imposition d’un potentiel membranaire Mesure d’un courant 100 pA 75 ms pA mV Assmann (2001) Plant Physiol.

33 Adressage des protéines
Expression transitoire en protoplastes de protéines fusionnées avec une GFP

34 Canaux et transporteurs membranaires
Souvent : faible niveau d’expression Fonction définie essentiellement par : Spécificité de substrat Expression tissulaire Adressage membranaire

35 Exemple d’une P-ATPase
ADP P GFP Greffage d’une GFP sur une partie soluble

36 Green Fluorescent Protein
Aequorea victoria Spécificité de la GFP: pas de groupement prosthétique synthétisé séparément modification d’acides aminés de la chaîne polypeptidique Stucture « cannette de feuillets β »

37 Hexapeptide : FSYGVQ

38

39 Expression transitoire : principe
Insérer un fragment d’ADN codant un protéine dans un protoplaste Plasmide DNA double brin ou simple brin Observation directe de l’expression Pas forcément d’intégration chromosomique

40 Construction HMA4::GFP
Promoteur Protéine de fusion 2x35S GFP HMA4 Ampi Ori coli Réplication et sélection dans E. coli

41 Transformation de protoplaste
Préparer de grandes quantités de plasmide Transformation MaMg : Mannitol (0.5 M) MES-KOH (5 mM) pH 5,6 MgCl2 (15 mM) Polyethylène Glycol déstabilisation de la membrane

42 Transformation de protoplastes
300 µl PEG 40% 30 min sur glace 0-2 °C Rinçage par dilution / sédimentation : NaCl, CaCl2, Glucose Dans 300 µl de tampon 106 protoplastes 10 µg de plasmide 100 µg de « DNA carrier »

43 Expression Étaler les protoplastes rincés sur boite de Pétri
Incuber 4-48 heures à l’obscurité Observations (Ex 495 nm / Em 515 nm)

44 Un transporteur du plasmalemme : AtHMA4
Témoin : GFP soluble AtHMA4::GFP Verret et al. (2004) FEBS Lett.

45 Un transporteur de la membrane tonoplastique: AtNRAMP3
Thomine et al. (2003) Plant J.

46 Isolation de protoplastes spécifiques d’une assise tissulaire
Gène rapporteur GFP sous le contrôle d’un promoteur spécifique d’une assise tissulaire Prom GFP

47 Isolement de protoplastes de racines
Tri des protoplastes exprimant la GFP par cytométrie en flux Birnbaum et Bernfey 2004 Curr. Opin. Plant Biol.

48 Les protoplastes tissu-spécifiques: un outil de recherche polyvalent
Electrophysiologie Transcriptomique Protéomique

49 Exemple : transcriptome des cellules du centre quiescent
Nawy et al Plant Cell Fluorescence GFP Contre marquage IP Tri par cytométrie en flux

50 Hybridation sur puces à ADN
Nawy et al Plant Cell