Daniel Muller Stéphanie Weiss Sandrine Koechler Michael Heymann

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1 Laboratoire de Dynamique, Évolution et Expression des génomes de micro-organismes FRE2326
Daniel Muller Stéphanie Weiss Sandrine Koechler Michael Heymann Didier Lièvremont Marie-Claire Lett Philippe Bertin Messdames et messieurs je vais présenter les travaux effectuer au labo Problèmatique de l’arsenic est abordé implique au sein du gdr mémotox (mécanisme et modélisation du devenir des toxiques Inorganiques dans les milieux aquatiques continentaux Je commencerai par vous présenter la problématique de l’arsenic lié à la biogéochimie et toxicité;

2 Cycle biogéochimique Sol A Sol B Sources naturelles
agriculture puits As[III] Nappes phréatiques Micro-organismes industries Sources naturelles Sources anthropogéniques As[V] Formes immobilisées volcanisme fond géochimique Méthyl-As As L’arsenic est le 20ème élément le plus abondant de la croûte terrestre. Mais l’activité naturelle (tel le volcanisme, l’érosion des sols, les feu de forêts) et l’activité anthropique (pesticides : traitement de l’esca de la vigne, déchets miniers: mine d'or de Salsigne, industries pesticide électronique…) contribuent à augmenter la concentration de ce métalloïde dans différents compartiments de la biosphère. À cela il faut noté le rôle important des joué par les micro-organismes sur la mobilisation de l’arsenic inorganique et donc la biodisponibilité Les micro-organismes libèrent par oxydoréduction les formes inorganiques as3 et as5 qui sont aussi les plus toxique ces formes peuvent être méthylée par des organismes supérieures, voir volatilisé par d’autres micro-organisme La problématique de l’arsenic est liée au fait qu’il est un élément toxique. Dans l’inconscient collectif l’arsenic est synonyme de poison

3 Souche modèle ULPAs1 Cenibacterium arsenoxydans
Oxyde As[III] en As[V] (100 mg.L-1 en 2 heures) Résiste à 500 mg.L-1 en As[III] Multirésistante : Ni, Sb,Cd, Cr[III], Pb, Mn, Se, As[V] Mécanisme d’oxydation induit en présence d'As[III] (Weeger et al, 1999) Pour cette étude la souche ULPAs1récement nommée C. arsenoxidans a été employée, c’est une bactérie à Gram- appartenant au groupe des -Protéobactéries qui a été isolée lors d’un précédent travail, à partir d’un milieu contaminé par l’arsenic. Vous pouvez voir ici deux photo de microscopie, qui montre que la bactérie est un bacille possédant un flagelle polaire. La souche se caractérise par une transformation rapide et totale d’As[III] en As[V]. De plus elle résiste à de forte concentration en As[III] et à de nombreux métaux ce qui permettrait de l’utiliser par la suite dans un système de bioréhabilitation d’eaux contaminé par l’arsénite. Le système d’oxydation de l’As est situé sur la menbrane plasmique coté périplasme s’est avéré être inductible par l’As[III] intéressant pour la suite de l’étude. Le génome de cette souche a été séquencé, par le génoscope…. Pour cette études nous avons employé la stratégie par transposition aléatoire, que je vais vous présenter.

4 Les gènes de l’arsénite oxydase
Test au nitrate d’argent : - dosage qualitatif et rapide - As[III] couleur jaune; pas d’oxydation As[V] couleur brune; oxydation Simeonova et al. 2004 aoxD aoxC aoxB aoxA mini Tn5 insertion M1 mini Tn5 insertion M2 0,5kb AoxA: sous-unité de type Rieske AoxB: sous-unité catalytique AoxC: protéine à domaine nitroréductase AoxD: protéine cytochrome c-551 Muller et al., 2003 Mutants As[III] As[V] 3 min 6 min ULPAs1 La stratégie employée est la mutagénèse pasr transpositiion aléatoire d’un mini-Tn5 Permis de sélectionner des mutants induits par l’arsenic Collaboration avec le laboratoire de Leroy pour quantifié l’arsenic Mise au point d’un teste rapide 2 mutants Amplifier région adjacente par PCR inverse, et séquence Cette étude a permis de caractériser pour la première fois des gènes qui code une arsenite oxydase C’est une enzyme importante dans le rôle métabolique

5 Arsénite oxydase Caractérisation des gènes de l’arsénite oxydase
2H3AsO3+O2 HAsO42—+H2AsO4—+3H+ Mo 2e— AoxB 3Fe4S 1e— 2Fe2S AoxA 4H+ 1e— Des études d’expression ont permis de localiser l’arsénite oxydase au niveau du périplasme. Avec les données de séquences combiné au donné de Andersen et al, ont peut proposer un mévcanisme de fonctionnement de la cascade électronique Représentation schématique du mécanisme de fonctionnement probable de l’arsénite oxydase (d’après Vanden Hoven, 2004). L’arsénite est oxydé en arséniate au niveau du centre catalytique à molybdène de la grande sous-unité (AoxA). Les deux électrons sont ensuite transférés au centre [3Fe-4S] de AoxA d’où ils passent au centre [2Fe-2S] de la petite sous-unité de type Rieske (AoxB). Les électrons passeraient ensuite au cytochrome c551/552 (AoxD) qui est associé à AoxB, puis au CuA et à l’hème du complexe cytochrome c oxydase aa3. Quatre électrons seront nécessaires au total pour réduire l’O2 en H2O dans le cytoplasme, et quatre protons seront pompés hors de la cellule créant une force proton motrice qui peut être utilisée dans la production d’ATP. Les études de comparaisons au banque de gènes à permis de caractériser de nouvelles arsénite oxydase ce qui nous a amener à formuler des hypothèses quant à l’origine de de l’enzyme Aox. Périplasme AoxD CuA 1e— CuBaa3 4e— Cytoplasme 4H+ Caractérisation des gènes de l’arsénite oxydase

6 Aox : une paléo-enzyme AoxA AoxB
Retrouve différents organisme qui code cette protèine. En collaboration avec l’équipe du professeur Nitschke Ce serait une paléoenzyme Deux sous unités Il s’agit d’un hétérodimère présentant, et une grande sous-unité catalytique à cofacteur molybdoptérine (DMSO-réductase, formate déhydrogénase), evolution divergente. une petite sous-unité appartenant à la famille des protéines de type Rieske, dont font partie les complexes cytochrome b/c justement au niveau de la souche de Chloroflexus aurantiacus Une autre partie a été l’étude du stress arsenic, sur la souche modèle en effetles seules données actuelles consernes l’étude toxicologique de certaine lignée cellulaire eucaryote. Dans le but d’étudier le stress deux approches complémentaires ont été employé, l’analyses des mutants de transposition couplé a une analyse protéomique C. aurantiacus est une bactérie thermophile tandis que S. tokadaii et A. pernix appartiennent aux Archaea. Les environnements dans lesquels se trouvent ces microorganismes sont intrinsèquement riches en arsenic et peuvent être considérés comme des environnements à partir desquels la vie a pu débuter. L’avantage énergétique représenté par la récupération des électrons lors de l’oxydation de l’arsénite, aurait conduit à l’apparition précoce d’enzymes de type arsénite oxydase. Lebrun et al., 2003

7 Réponse à l’arsenic chez C. arsenoxidans
IEF IEF pI = 4 pI = 7 pI = 4 pI = 7 21 9 10 22 11 12 1 2 13 14 15 18 3 19 16 17 4 5 6 7 20 8 Mr (kDa) Afin d’évaluer les effets de l’arsenic sur la souche C. arsenoxidans nous avons identifier les protéines dont l’accumulationest altérée en présence d’arsenic. Comparaison des profils de gel de protéines bidimentionnelle, qui ont été réaliser par Évelyne Turlin dans le laboratoire du professeur Danchin et l’analyse des spot a été réalise par Christine carapito, qui vous expliquera certainement le fonctionnenemt, 1D suivant, de culture de la souche C. arsenoxidans cultivée en présence ou absence d’arsenic. Le profil général reste semblable dans les deux conditions, seule l’accumulation d’environ 22 protéines est altéré en présence d’arsenic l’arsenic soit surexprimé (carrés) Soit réprimé les losanges Les spots ont été extrait digèré et analyse par spectro de masse, séquençage de novo des peptides qui ont été comparé au banque de données a permis d’identifier les protéines correspondantes au spot. Les protéines présentant un intérêt (expression ou surexpression induite par l’arsenic) sont extraites des gels pour être analysées par spectrométrie de masse. Pour des raisons pratiques (qualité des gels, reproductibilité…) ces extractions ont été réalisées par Evelyne Turlin à l’Institut Pasteur de Paris à partir de gels à deux dimensions réalisés sur place. L’analyse par spectrométrie de masse à été réalisée au Laboratoire de Spectrométrie de Masse Bio-Organique (ECPM, Cronenbourg) par Christine Carapito en utilisant une méthode de digestion trypsique et de spectrométrie MALDI-TOF, ainsi que la technique de séquençage de novo. On note que différentes protéines du métabolisme des méthionines spot 9, 11, 14 et 3 En complémént de cette études la collection de mutant dont le gène rapporteur est induit en présence d’arsenic a été analysé p 21 Sans As[III] 2 mM As[III]

8 Stress Arsenic Réponse au stress arsenic
Ainsi l’ analyse bidimentionnelle a permuis de 22 P° et L’analyse des mutants permet de caractériser 16 gènes différents L’on constate que toutes les protéines du métabolisme cellulaire Toutes les catégories fonctionneles sont représenter mettant en évidence l’effet pléotrope de l’arsenic sur la cellule Aucune protéines commune au deux méthodes, qui qui du au condition et au limite des deux techniques mais des enzyme qui interviennent dans les memes voie de régulation. Exemple réparation Métabolisme de l’arsénite Lié au soufre 9, 11, 14 3 et M3 relation avec le soufre AsIII forte affinité Système de résistance 2 approches complémentaier sur les quels on se focalise Cette étude permet aussi pour la première fois de caractériser de arséniate réductases (protéines arsC), qui sont pour la première fois caractériser dans une souche oxydante. Ce qui nous amène à présenter la troisième partie Réponse au stress arsenic

9 Opérons de résistance Bactéries GlpF ArsB As[III] ADP ATP Pit ArsC
As[V] ArsA Opérons de résistance 0,5kb Operon arsB1 61% 71% 59% 14% 74% 57% 44% 54% 63% regulation Arsenate reductase Arsenite pump Flavoprotein arsR arsCa arsB MSF transporter arsH arsCb permease 236 aa 251 aa 117 aa 185 aa 426 aa 111 aa 171 aa 303 aa 142 aa 107 aa 164 aa 356 aa 384 aa 140 aa 245 aa Operon arsA1 Operon arsB3 Membrane protein Nébulisation Clonage Transformation

10 Induction des opérons ars
Rapport d'expression des gènes arsB arsBB1 Rapport d’intensité arsBB3 arsBA1 rrn 0 As ppm ppm 1/4 h /2 h Mesure de l’expression des gènes par la technique du slot blot sur l’ARN total. Photos du slot Graph avec representation de l’expression différentiel de l’opéron Ces résultats montrent une expression différentielle importante pour les opérons arsB1 et arsB3. En effet, en absence d’arsenic, les trancrits aoxB de ces deux opérons ne sont pas détectables, mais après 15 minutes de culture en présence d’As[III], la réponse est importante. Au contraire, le gène arsB de l’opéron arsA1 semble être transcrit de manière constitutive à un niveau basal, et ne serait quasiment pas induit par As[III] à la concentration testée (0,75 mM). Les expériences d’hybridation, type northern, confirment les observations précédentes de l’expression différentielle des protéines ArsC. En effet, seuls les opérons arsB1 et arsB3 sont réellement régulés par l’arsenic dans les deux cas. C’est pourquoi l’opéron arsA1 n’est peut-être pas visible en protéomique, car il n’y pas d’altération du profil d’induction. Système de résistance à l’arsenic