Directeur :Pr Martine Daoust Maître de stage : Dr Mickaël Naassila

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1 Directeur :Pr Martine Daoust Maître de stage : Dr Mickaël Naassila
Carine Cantet Effet de l’alcoolisation précoce chez le rat sur l ’expression de BDNF et NMDAR1 et sur la sensibilité aux effets récompensants de la cocaïne Directeur :Pr Martine Daoust Maître de stage : Dr Mickaël Naassila FACULTE DE PHARMACIE Groupe de Recherche sur l’Alcool et les Pharmacodépendances (GRAP) JE2462

2 INTRODUCTION Consommation d’alcool pendant la grossesse => syndrome d’alcoolisation fœtale (SAF) SAF : Retards de croissance (mentaux) déficits d’apprentissage et de mémorisation vulnérabilité à développer une dépendance Résultats préliminaires du labo chez le rat: Alcoolisation précoce modifie l’expression (ARNm) de certains gènes: Modifie la sensibilité aux effets récompensants de la cocaïne 10 et 20mg/kg  augmentation ARNm BDNF (facteur de croissance neuronale)  diminution ARNm sous-unité NR1 du récepteur NMDA (joue 1 rôle dans les processus de mémorisation)

3 Objectifs du stage Effet de l’alcoolisation précoce sur :
la sensibilité aux effets récompensants de la cocaïne 25mg/kg (PPC) Quantifier l’expression des protéines BDNF et NR1 (Western-blot)

4 Protocole d ’alcoolisation
Alcoolisation forcée des mères avec éthanol 10% dans l’eau de boisson (comme seule source de fluide) Sevrage (mère et alcool) à l’âge de 21 jours et les expériences sont réalisées à l’âge de deux mois.

5 Préférence de Place Conditionnée
Principe :  test comportemental  injection cocaïne (25mg/kg) et solution saline dans un environnement donné association environnement avec effet de la cocaïne Plus l’animal ressentira des effets positifs de la cocaïne plus il passera de temps dans le compartiment où il a reçu la cocaïne (effets récompensants) Un animal sera d’autant plus vulnérable à devenir dépendant à la cocaïne qu’il est sensible à ses effets récompensants

6 Protocole d ’expérimentation

7 Résultats

8 Western-blot But : Quantifier des protéines Plusieurs étapes :
1er jour: gel, migration, transfert, incubation Ac Iaire 2èm jour: incubation Ac IIaire, révélation chemiluminescence Extraction :  prélèvement des structures (cortex, hippocampe) chez des rats SAF ou non 1.5 ml de tampon d’extraction cocktail inhibiteurs de protéases  centrifugation 300g 30 min 4°C  surnageant centrifugé 15000g 5 min 4 °C  récupération du surnageant

9 Western-blot Dosage des protéines
 méthode de Lowry-Folin; gamme d’étalonnage de SAB (10-100mg/ml)  à partir de 10 et 20 µlitres de protéines extraites lecture des absorbances à 750 nm La même quantité de protéines sera chargée dans tous les puits du gel d’électrophorèse

10 Western-blot 1. Préparation du gel SDS-PAGE ?? % ?? %

11 Western-blot 2. Migration et séparation Seringue Hamilton
préparation des échantillons : -5 µg prot -tampon de migration  Dénaturation des protéines Chargement des puits Marqueur de poids moléculaire  migration 1h à 200V Seringue Hamilton

12 Migration et séparation des protéines

13 3. Transfert sur membrane de nitrocellulose
Tampon de transfert Sens de migration Transfert humide 2 h à 105 V

14 4. Etape de saturation incubation 1h dans du PBS-Tween 0.05% + lait 5% 5. Incubation de l’anticorps Iaire (préparé chez le lapin) spécifique protéine cible  dilution de l’Ac incubation dans PBS-T + lait 3 lavages dans du PBS-T 6. Incubation de l’anticorps IIaire (anti lapin)  incubation dans PBS-T + lait  1 lavage dans PBS

15 Révélation IIaire Iaire Protéine cible

16 Résultats