Adeline Granzotto Emilie Mendiburu

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1 Adeline Granzotto Emilie Mendiburu
Les sondes froides

2 Définition Radical R: Biotine + chaine carbonnée Sonde froide: c'est un enchaînement de nucléotides définis qui vont s'hybrider avec la séquence a révélé .Cet enchaînement est lié a la biotine attachée au bout d'une chaîne carbonée de longueur variable. La biotine est alors révélée par un système d'amplification de type immunochimique.

3 Les sondes froides et l' hybridation moléculaire
Les sondes froides sont utiliser pour l' hybridation moléculaire Hybridation moléculaire : technique permettant de mettre en évidence au sein d'une cellule ou d'un tissu, une séquence d'acide nucléique, par exemple de localiser un locus sur un chromosome. Elle est basée sur le principe de complémentarité des bases nucléiques, plus particulièrement entre l'ADN et le brin d'ARN de séquence complémentaire. Le brin de séquence complémentaire est aussi appelé sonde et généralement "marquer" pour le localiser. Il existe donc des "sondes radioactives" et des "sondes froides".

4 Hybridation moléculaire
L'HIS ( Hybridation In Situ) est un outil incomparable pour étudier l'expression des gènes. Elle apporte ainsi des informations précises sur la localisation des acides nucléiques étudiés. Le mode de révélation des sondes varie en fonction de la nature du marquage, microscopie à fluorescence en cas de FISH, avidine ou streptavidine pour la biotine, anticorps marqués par un enzyme et/ou par l'or colloïdal pour la digoxigénine, anticorps ou chromogènes pour les enzymes.

5 Technique FISH Hybridation sur chromosomes (FISH) Cette technique est aujourd'hui l'outil principal actuel de la cytogénétique moléculaire. Les applications en sont multiples tant en recherche (cartographie, organisation de la chromatine,...) qu'en diagnostic (caractérisation ou détection d'un remaniement chromosomique de petite taille). La technique FISH est utilisée pour la détection prénatal de la trisomie 21.

6 Technique de Random La technique de random priming que nous utilisons, consiste ainsi à polymériser le brin complémentaire entre des hexamères de monobrin (brins composés de six nucléotides aléatoires), suivant le principe indiqué sur le schéma ci-dessous:

7 Protocole de marquage Le marquage de sonde par phosphorylation à l’ATP-γ32P consiste à marquer un oligonucléotide à son extrémité 5’ puis à l’apparier à un oligonucléotide complémentaire. - 50 ng d’un oligonucléotide ont été mélangés avec: - 1 μl du tampon kinase 10X, - 5 μl d’ATP-γ32P (250 μCi/μl), - 1 μl de T4-PNK puis le volume a été ajusté avec de l’eau jusqu’à 10 µl. La solution est incubée à 37°C pendant une heure. Ensuite, 150 ng du deuxième oligonucléotide, complémentaire à celui marqué, ont été ajoutés avec 1 μl de NaCl (1.5M) et de l’eau pour un volume final de 15 μl. La sonde a été chauffée à 95°C pendant 5 min et refroidie graduellement durant 2 heures.

8 Révélation La révélation se fait par fixation sur la biotine de l'avidine puis fixation d'un anticorps anti-avidine fluorescent. Cet anticorps fluorescent est alors excité, il récupère la lumière émise par les sites fluorescent et l'emet.

9 Conclusion Ces sondes froides présentent un problème de sensibilité et leur utilisation ne fait pas toujours l'unanimité. Elles n'ont pas les inconvénients d' utilisation et de retraitement des sondes radioactives.

10 Bibliographie