Responsable: Didier Cabanes

Présentation au sujet: "Responsable: Didier Cabanes"— Transcription de la présentation:

1 Responsable: Didier Cabanes
Identification de nouveaux gènes de Listeria monocytogenes codant pour des protéines LPXTG, impliquées dans l’infection Group of Molecular Microbiology Responsable: Didier Cabanes Mélanie Leroux

2 Listeria monocytogenes
Bactérie Gram positive Contamination par l’alimentation Survie dans des conditions environnementales extrêmes Listériose: Taux de mortalité = 30% Gastroentérites Méningites Listériose néonatale Avortement Bacillus are

3 Cycle d’infection de l’hôte
Nourriture Contaminée par L. monocytogenes Cerveau Foie Barrière Hémato-encéphalique Vaisseaux sanguins Vaisseaux sanguins Intestins Barrière intestinale Barrière Placentaire Rate Fœtus

4 Cycle d’infection cellulaire
Adhésion Entrée Lyse de la vacuole Multiplication. Polymérisation de l’actine Mouvement intracellulaire Passage de cellule à cellule Vacuole à double membrane Lyse de la vacuole à double membrane 1 2 8 3 7 4 5 6

5 Protéines de surface LPXTG de L. monocytogenes
le motif LPXTG est ancré de relié de manière covalente au peptidoglycane. réaction catalysée par la Sortase A.

6 Mon projet → Consortium Européen (ERA-Net) : mutagenèse systématique et analyse de toutes les protéines de surface LPXTG de L. monocytogenes. → Etude de 3 gènes: lmo1289, lmo0842 et lmo0627 Méthode (pour chaque gène): Création d’un vecteur de mutagenèse. Mutagenèse par double recombinaison. Etude du phénotype des mutants.

7 Construction du vecteur
Vecteur : pMAD Origine de réplication pour E. coli. Gène codant pour la résistance à l’Ampicilline BamHI SalI MluI EcoRI SmaI NcoI BglII pMAD 9666pb Multiplecloning site Origine de réplication pour L. monocytogenes: thermosensible (30°C active, 42°C inactive) . Gene codant pour la résistance à l’Erythromycine

8 Primer-A Primer-C Fragment amont Gene Fragment aval Primer-B Primer-D
Enzyme 1 Enzyme 2 Fragment amont Gene Fragment aval Enzyme 2 Enzyme 3 Primer-B Primer-D PCR Enzyme 1 Enzyme 2 Enzyme 2 Enzyme 3 Multi-site de clonage: Ezymes 1,2, 3 Enzyme 1 Enzyme 1 Enzyme 2 Enzyme 2 Enzyme 2 Enzyme 2 Enzyme 3 Enzyme 3

9 Vérification des constructions des vecteurs par PCR
Primer-A Primer-A Primer-C Fragment amont Fragment aval Primer-B Primer-D Primer-D

10 Mutagenèse par double recombinaison
1) Transformation de L. monocytogenes par électroporation. 2) Réplication du plasmide → BHI + Erythromycine à 30°C 3) Intégration du plasmide dans le génome de L. monocytogenes EGDe = 1ère recombinaison. → BHI + Erythromycine à 43°C Fragment amont Gène à deleter Fragment aval Gene codant pour la résistance à l’Erythromycine Origine de réplication pour L. monocytogenes: thermosensible (30°C active, 42°C inactive) . Fragment amont Fragment aval Fragment amont Gène à deleter Fragment aval pMAD

11 pMAD 4) Excision du plasmide = 2nd recombinaison → BHI à 30°C MUTANT
Fragment amont Fragment aval Fragment amont Gène à deleter Fragment aval Fragment amont Fragment aval MUTANT 5) Sélection négative des bactéries ayant excisé le plasmide → BHI et BHI + Erythromycine à 37°C 6) Vérification de la mutagenèse par PCR.

12 Vérification des mutants:
Δlmo1289, Δlmo0842 et Δlmo0627 Primer-A Primer-F Primer-C Fragment amont Gene Fragment aval Primer-B Primer-R Primer-D Primer-A Primer-C Fragment amont Fragment aval Primer-B Primer-D

13 Courbes de croissance → Les délétions des gènes lmo0842 et lmo1289, n’ont pas d’effet sur le croissance des bactéries.

14 Tests d’invasion → lmo1289 et lmo0842 ne semblent pas être impliqués dans le phénotype d’entrée dans les cellules de type CACO-2. → lmo0842 et lmo1289 plus particulièrement semblent être impliqué dans le phénotype d’entrée dans les cellules de type JEG-3.

15 Perspectives Répéter ces expériences.
Tests d’invasion sur d’autres types cellulaires. Etude des autres phénotypes in vitro : adhésion, multiplication intracellulaire, mobilité intracellulaire, passage de cellule à cellule. Etude de la virulence in vivo : infection de souris. Consortium Européen: mise en commun des résultats concernant toutes les protéines LPXTG de L. monocytogenes.

16 Remerciements: Didier Cabanes Olga Reis Filipe Carvalho Ana Camejo Filipa Henriques Sandra Sousa Mariana Martins Université Paris7 Huguette Leivobici Philippe Régnier Université de Porto IBMC