Comparaison de différentes méthodes de dosage de protéines

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1 Comparaison de différentes méthodes de dosage de protéines

2 Méthodes colorimétriques les plus courantes pour la détermination de la concentration en protéines
Bradford Biuret Lowry Référence Bradford, M. (1976) Anal. Biochem. 72, Gornall et al. (1949) J. Biol. Chem. 177, 751 Lowry et al. (1951) J. Biol. Chem. 193, 251 Réactif Le bleu de Coomassie (s'adsorbe sur le verre des cuves qu'il faut nettoyer fréquemment) Le biuret (NH2-CO-NH-CO-NH2) Le biuret et le réactif de Folin-Ciocalteu (phosphomolybdate et phosphotungstate ) Groupements réactifs Réaction avec l'Arg et, dans une moinde mesure, avec l'His, la Lys et les acides aminés aromatiques Formation d'un complexe pourpre avec la liaison peptidique en présence de cuivre à pH basique Le réactif de Folin-Ciocalteu réagit avec la Tyr et le Trp et, dans une moinde mesure, avec la Cys, l'His et la liaison peptidique λ mesure 595 nm (bleu de Coomassie seul : 465 nm) 545 nm (ou 300 nm) 745 nm

3 Rapidité et complexité Méthode simple et très rapide
Sensibilité Elevée (seuil = 1 µg) Faible (seuil = 100 µg) Rapidité et complexité Méthode simple et très rapide Méthode simple et moyennement rapide Méthode moyennement simple et moyennement rapide Interférence Dosage peu influencé par la présence d'autres molécules sauf les détergents et les bases fortes Dosage influencé par les autres solutés Dosage fortement influencé par les autres solutés. Variation d'une protéine à une autre Forte : la protéine de référence (l'albumine de sérum bovin ou BSA, "Bovine Serum Albumin") est une protéine globulaire peu représentative de l'ensemble des protéines. La γ-globuline, parfois employée, est une protéine qui est une meilleure protéine de référence. Faible : la formation du complexe est à peu prés équivalente pour toutes les protéines puisque le biuret réagit avec la liaison peptidique Forte

4 Dosage par la méthode de Folin-Lowry
Liaison peptidique: Milieu alcalin: complexation avec les ions Cu2+ L’ammoniac et certaines amines peuvent interférer avec ce dosage (eg. tampon TRIS, sels d’ammonium sulfate). Cette méthode n’est pas non plus utilisable pour le dosage des glycoprotéines.

5 Dosage de Bradford Le nom anglais du réactif de Bradford est : "Bradford Coomassie brilliant blue G-250 protein-binding dye". Le pigment ("dye") existe sous forme cationique, neutre et anionique

6 Sa longueur d'onde d'absorbance maximale est 465 nm.
Le pigment forme un complexe avec les protéines : sa structure est modifiée par cette interaction et sa longueur d'onde d'absorbance maximale est déplacée de 465 à 595 nm L'interaction pigment - protéine s'effectue essentiellement avec : les résidus d'acides aminés hydrophobes des résidus d'acides aminés basiques (arginine - lysine et histidine) les forces de Van der Waals contribuent aussi à la formation du complexe Le nombre de molécules de pigment fixé par molécule de protéine est approximativement proportionnel au nombre de charges positives portées par la protéine. Le pigment ne réagit pas avec les acides aminés libres. La masse du peptide ou de la protéine doit être au moins de 3 kDa.

7 En absence de protéine, la couleur du réactif seul est marron (à gauche - figure ci-contre).
Plus la concentration en protéine est élevée, plus celle du complexe formé l'est aussi : la couleur est de plus en plus bleue (à droite - figure ci-contre). Le développement de cette couleur bleue n'est proportionnelle à la concentration en protéine que dans une gamme de quantité limitée (précisée par le fabriquant). Au-delà, il n'y a plus proportionnalité : d'où l'importance d'établir une gamme étalon précise.

8 Le complexe n'est stable que pendant un temps limité :
il faut donc préparer en même temps les mélanges pour la gamme étalon et pour les échantillons, à température ambiante. il faut effectuer les lectures de la gamme étalon et des échantillons au même moment. Il est à noter que le bleu de Coomassie est un moyen de réveler les protéines dans les gels d'électrophorèse même si ça n'est plus la méthode de choix du fait du développement de réactifs beaucoup plus sensibles qui permettent de détecter des quantités bien inférieures (par exemple les fluorophores).

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12 Conditions d’obtention d’une gamme étalon correcte :
Concentration faible Volume total des solutions dans chaque tube de la gamme constant Concentrations des tubes régulièrement réparties Concentration de la protéine à doser au milieu de la gamme.

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20 Extraction spécifique des protéines
EXTRAIT BRUT Tampon d’extraction: Tampon d'extraction des protéines TE : 125 mM Tris-HCl, pH=8,8 50 mM Na2S2O5 (thiosulfate de sodium) 10 % glycérol (v/v) 1 % SDS (w/v) Extraction spécifique des protéines

21 Centrifugation Définition
La centrifugation est une opération de séparation mécanique, par action de la force centrifuge, de deux à trois phases entraînées dans un mouvement de rotation. On peut séparer deux phases liquides, une phase solide en suspension dans une phase liquide, voire deux phases liquides contenant une phase solide. Dans le cadre du traitement de déchets, elle est utilisée afin de séparer les diverses phases en vue d'un traitement spécifique. Par exemple, des boues humides ainsi traitées donneront une phase liquide et des boues sèches qui iront chacune sur une chaîne de traitement particulière (épuration pour la phase aqueuses et valorisation pour les boues).

22 Principe Si on laisse reposer une suspension solide dans une phase liquide, on observe que les particules, sous l'action de la pesanteur et de la poussée d'Archimède, tendent à tomber vers le fond ou à remonter vers la surface selon leur densité et leur taille. Ce procédé, la décantation, est cependant relativement lent pour les très fines particules (sensibles à l'agitation thermique) et les liquides particulièrement visqueux. On a donc eu l'idée de décupler le pouvoir séparateur du champ de pesanteur vertical en lui substituant un champ centrifuge radial. Il s'agit donc d'entraîner un appareil (le "bol") à grande vitesse, en rotation autour d'un axe. Son accélération, proportionnelle à la distance à l'axe de rotation, varie comme le carré de la vitesse. À tr/mn, on obtient, à 10 cm de l'axe, une accélération mille fois plus grande que celle de la pesanteur. Dans le cadre du traitement des effluents, le coefficient de centrifugation se situe en général autour de g. On peut agir sur plusieurs paramètres pour augmenter l'efficacité de la centrifugation : le diamètre des particules, en utilisant des floculants. la différence de densité. la viscosité du fluide, qui diminue avec l'élévation de la température. la surface de base du bol. la vitesse de rotation, qui laisse la plus grande latitude de réglage.

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