Mécanismes de variabilité génétique

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1 Mécanismes de variabilité génétique
Caractérisation moléculaire des mécanismes de résistance aux antibiotiques

2 Variabilité génétique
Modification de gènes endogènes Acquisition de gènes exogènes Exemple : Mutation dans le chromosome (gène endogène) Gène exogène Pénétration du plasmide par conjugaison Plasmide conjugatif (naturellement absent de l’espèce bactérienne) Chromosome

3 Chromosome Plasmide conjugatif bactérien
Nouveau gène de résistance Mutation ( ) du gène chromosomique ( ) naturellement présent dans l'espèce bactérienne Pénétration du plasmide par conjugaison Chromosome bactérien Plasmide conjugatif Possibilité d'intégration du gène de résistance plasmidique dans le chromosome par des phénomènes de recombinaison homologue, de transposition. Division cellulaire Cellule fille sans plasmide de résistance. La résistance plasmidique peut être perdue. Par contre, le gène chromosomique muté est transmis à toutes les cellules filles. C'est un caractère permanent Division cellulaire

4 Les mutations Définition: C’est un changement qui affecte la séquence nucléotidique Une mutation dans un gène toutes les 106 à 109 divisions cellulaires. Elles sont dues à des erreurs commises par l’ADN polymérase lors de la réplication. Variation > sélection > adaptation Stabilité: Transmission à la descendance (transmission horizontale)

5 Chromosome Plasmide conjugatif bactérien
Nouveau gène de résistance Mutation ( ) du gène chromosomique ( ) naturellement présent dans l'espèce bactérienne Pénétration du plasmide par conjugaison Chromosome bactérien Plasmide conjugatif Possibilité d'intégration du gène de résistance plasmidique dans le chromosome par des phénomènes de recombinaison homologue, de transposition. Division cellulaire Cellule fille sans plasmide de résistance. La résistance plasmidique peut être perdue. Par contre, le gène chromosomique muté est transmis à toutes les cellules filles. C'est un caractère permanent Division cellulaire

6 La mutation à l’échelle moléculaire => Changement de la séquence nucléotidique
Mutations par substitution, addition ou délétion de bases nucléotidiques : - Substitution: A --> G - Addition: ATCG --> ATGCG (modification du cadre de lecture) - Délétion: ATGCG--> ATCG (modification du cadre de lecture) Les mutations peuvent être: - Silencieuses (ex: TCT (ser) --> TCC (ser)) - Létales (ex: TGC (cys) --> TGA (codon stop)) (protéine tronqueé) - Intermédiaires (ex: CTT (leu) --> ATT (ile) (se traduit par un changement d’acide aminé)

7 Détection des mutations ponctuelles
Amplification génique (PCR) et séquençage du produit d’amplication Extrait d’ADN Primers dNTP Taq polymerase + mgCl2 35 cycles 72°C 10:00

8 Témoin de masse moléculaire
Electrophorèse des produits de PCR Témoin de masse moléculaire 1 2 3 4 5 1 kb 500 pdb 200 pdb Purification des produits de PCR

9 Brin d’ADN Séquençage technique Dye terminator (méthode de Sanger)
dCTP dTTP dATP dGTP nucléotides non marqués nucléotides marqués Séparation des brins d'ADN néoformés en fonction de leur taille par chromatographie

10 Lecture du chromatogramme -> détermination de la séquence nucléotidique

11 Analyse de la séquence à l’aide du logiciel BLAST

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14 Les transferts d’information génétique (transfert horizontal)
Transformation Conjugaison Transduction

15 La transformation Définition: Transfert passif dans une cellule bactérienne d'ADN nu. a. L'ADN qui est introduit dans la bactérie provient d’une cellule bactérienne morte. Il est libéré sous forme bicaténaire dans le milieu extérieur. b. 1ère étape :Fixation covalente de l’ADN à un complexe protéique membranaire : le "Transformasome" c. 2ème étape : Fragmentation de l'ADN (nucléases), destruction d’un brin d’ADN. d. 3ème étape : Entrée de l'ADN simple brin dans la bactérie e. 4ème étape : Devenir de l'ADN simple brin transformant dans la bactérie. Transformasome Paroi bactérienne Fixation Fragmentation Entrée

16 Devenir de l'information génétique échangée par transformation naturelle
Pour que le processus de transformation soit durable il faut qu’il y ait une recombinaison homologue entre le brins d’ADN introduit et le génome de la souche réceptrice (nécessité de larges homologies entre l'ADN exogène et endogène) Gène exogène introduit par transformation 1 Recombinaison homologue = remplacement du gène d'origine par un nouveau gène présentant une forte homologie de séquence Gène sauvage 2

17 En règle générale : l'ADN provient de la même espèce bactérienne ou d'une espèce bactérienne proche
Le résultat : mutations ponctuelles, délétions, insertions dans le génome, qui créent de nouveaux caractères génétiques stables transmissibles à la descendance. fragments de gène de Streptococcus mitis Exemple des PLP du pneumocoque (Streptococcus pneumoniae) gène sauvage du pneumocoque Recombinaison homologue Gène mosaïque PLP hybride

18 Neisseria spp., Streptococcus  hémolytiques sont des bactéries naturellement compétentes
Le fragment d’ADN peut se recombiner en raison de la proximité phylogénétique entre les espèces (recombinaison légitime).

19 Transformation (in vitro)
Choc électrique Extrait d’ADN plasmidique de la souche résistante (ex : aux pénicillines) Sélection sur gélose contenant amoxicilline Cuvette d’électroporation Cellules réceptrices (cellules électrocompétentes) Utilisations : 1) Transfert d’un plasmide sauvage dans une cellule réceptrice 2) Transfert d’un plasmide recombinant

20 Principe du clonage aléatoire
Digestion par une enzyme de restriction (ex : sau3AI) électroporation + ligation ADN total extrait bactéries transformées = transformants plasmides recombinants Plasmide d'expression linéarisé (ex : BamHI)

21 Site de restriction des endonucléases : généralités
Site de restriction des enzymes Sau3AI et BamHI

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23 Transformation chimique
Les bactéries sont cultivées et centrifugées pendant leur phase de croissance exponentielle (phase de compétence maximale) environ 6 à 8 heures après le début de l’incubation sous agitation en milieu liquide Remise en suspension dans une solution contenant des cations bivalents (MgCl2) Choc thermique à 42°C (1 minute). Pénétration de l’ADN double brin 2 l d’extrait d’ADN plasmidique Choc thermique + 42°C Sélection sur gélose contenant amoxicilline Cellules compétentes congelées à -80°C

24 La conjugaison (la sexualité des bactéries)
Définition : Processus qui implique un transfert unidirectionnel d’ADN d’une cellule donatrice à une cellule réceptrice, par un mécanisme requérant un contact spécifique. Formation d’un pont cytoplasmique. véhicule :- plasmides gène rep (impliqué dans l'autoréplication) gène tra (impliqué dans le transfert) Plasmide Chromosome

25 Les plasmides sont des moléculaire bicaténaire circulaire capable d’autoréplication (gènes rep) dans la cellule. Ils ont une origine de réplication OriV. Ils se caractérisent par leur groupe d’incompatibilité (Inc) : les plasmides appartenant au même groupe ne peuvent pas coexister dans une même cellule La spécificité d’hôte : certains plasmides ne peuvent se répliquer que dans certaines espèces bactériennes

26 Leur caractère conjugatif ou mobilisables
Certains plasmides sont conjugatifs ils possèdent les gènes codant pour la fonction Tra que l’on peut décomposer en composante Mpf (Mating pair formation) qui permet la formation du pili sexuel et la composante Dtr (DNA transfer and replication) qui permet le transfert réplicatif. Plasmides mobilisables possèdent les gènes Dtr uniquement. Ils empruntent le pili synthétisé grâce à un autre plasmide qui réside dans la même cellule.

27 La conjugaison comporte plusieurs étapes
synthèse du pili sexuel par la cellule donatrice Fixation du pili sur une cellule réceptrice (sur des sites spécifiques) Raccourcissement du pili Transfert réplicatif du brin d’ADN de la cellule donatrice vers la cellules réceptrice

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29 24 heures d’incubation à 37°C
Bactérie réceptrice (ex E. coli J53; AzideR) Conjugaison en milieu liquide Bactérie donnatrice (ex: résistance aux pénicillines) Conjugaison en milieu solide 24 heures d’incubation à 37°C Sélection sur gélose contenant azide + amoxicilline

30 La transposition Mécanisme permettant la mobilisation de fragments d’ADN entre deux supports génétiques différents (ex : entre un plasmide et un chromosome) caractérisé par des structures génétiques particulières : les transposons. Classification des transposons: en fonction de leur capacité à s’autorépliquer lors de l’insertion du fragment d’ADN et en fonction de la présence ou de l’absence de gènes tra (impliqués dans la conjugaison), on distingue trois grandes familles de transposons - Les transposons composites - Les transposons de type Tn3 - Les transposons conjugatifs (transposons possèdant des gènes tra).

31 Les transposons composites
Le mécanisme d’action des transposons composites repose sur une structure de base= la séquence d'insertion (IS) IRL IRR mARN Transposase tnp Séquences inversées répétées (10 à 40 pb) sont impliquées dans la phase de coupure de l’ADN par la transposase (excision, transposition). ATGCA TACGT Site d’insertion IS IS : séquence d'insertion IR : séquence inversée répétée tnp : transposase

32 ACGGA TGCCT Site d’insertion IS ATGCA IS ATGCA TACGT TACGT ATGCA TACGT IS ACGGA TGCCT ATGCA TACGT IS ACGGA TGCCT Intégration du fragment d’ADN compris entre les deux séquences d’IS sur un nouveau support génétique (transposition conservative)

33 TTGACA TACAAT Partie codante du gène 17 pdb -35
-10 Partie codante du gène 17 pdb ARNm Partie promotrice du gène

34 Transposon composite Deux IS coopèrent pour former un transposon composite. Exemples : Tn10 constitué de deux IS 10 et contenant des gènes de résistance à la Tétracycline Tn9 constitué de deux IS1 et contenant un gène de résistance au chloramphénicol

35 Les transposons non composites
Les transposons non composites se caractérisent par l’absence d’IS aux extrémités mais par la présence d’IR Exemple : Tn3, qui est encadré par deux IRR et IRL et contient une transposase (tnpA), pour l’insertion, et une resolvase (tnpR), pour l’excision, ainsi qu’un site de recombinaison res, et une gène de résistance aux antibiotique (blaTEM).

36 Transposon conjugatif
Gène de la recombinase Gène de l’excisionase Combine à la fois les propriétés d’un plasmide conjugatif car il contient les gènes Dtr et MpF et une OriT et les propriétés d’un transposon car il contient des IR et des gènes xis et int codant pour une excisionase et une recombinase.

37 Les transposons mobilisables
Les transposons mobilisables ne possèdent pas la composante Mpf. Ils possèdent la capacité de se transposer et profitent d’un plasmide conjugatif résidant dans la cellule pour se transférer par conjugaison.

38 Chromosome Plasmide 1 2 1) Conjugaison 2) Transposition

39 Les systèmes de capture de gènes: les intégrons
Mécanisme permettant la mobilisation de gènes dans des structures génétiques particulières : les intégrons Il existe quatre classes d’intégrons. Les plus répandus sont les intégrons de classe 1. Ils se caractérisent par le gène int1 qui code pour une intégrase. Cette enzyme catalyse l’intégration des gènes cassettes mobiles dans l’intégron au niveau du site de recombinaison attI.

40 Mécanisme de capture de gènes par les intégrons de classe I
ant intI1 qacE∆ sul1 intégrase attI 3'- conserved segment Les gènes cassettes sont constitués d’un cadre ouvert de lecture associé et d’un site de recombinaison attC. attC gene cassette Int P ant Gene intI1 attI attC qacE∆ sul1

41 Les intégrons : systèmes de capture et d’expression de gène
Ce sont des vecteurs naturels de clonage car permet d’intégrer un cadre ouvert de lecture et de lui fournir un système d’expression.

42 Exemple d’intégrons et combinaison de plusieurs mécanismes de transfert de gènes
intI1 qacED1 sul1 orf5 qacH aadB aacA1/orfG veb1 aadB arr2 cmlA5 oxa10 aadA1 P. mirabilis Lil-1 IS26 qacED1 sul1 orf5 IS26 In53 qacH aadB aacA1/orfG veb1 aadB arr2 cmlA5 oxa10 aadA1 E. coli MG-1

43 La transduction et la conversion lysogénique
Définition : Transfert d'ADN bactérien d'une bactérie à une autre par l'intermédiaire d'un bactériophage. Vecteur = Bactériophages (Transducteurs) Processus essentiellement intra spécifique (échange d'ADN entre des bactéries d'une même espèce) Plusieurs types de transductions 1. La transduction généralisée 2. La transduction spécialisée 3. La transduction abortive 4. La conversion lysogénique

44 Cycle de multiplication d'un bactériophage virulent
PÉNÉTRATION LIBÉRATION ASSEMBLAGE MULTIPLICATION ÉCLIPSE LATENCE

45 La transduction généralisée Transfert qui concerne n'importe quelle partie du génome bactérien
Infection d ’une bactérie A B Mécanisme de la transduction généralisée : * Fragmentation du génome bactérien au cours de la réplication virale (nucléases virales ou non spécifiques). * Les particules encapsident de l'ADN bactérien. * Formation de particules transductrices infectieuses capables d'injecter l'ADN bactérien dans une autre cellule. * Devenir de l'ADN transduit: remplacement allélique Mécanisme de la transduction abortive : Les gènes transférés ne sont pas intégrés dans le chromosome (perte de l ’information génétique au cours des divisions cellulaires) Infection d ’une bactérie a b a b c Injection A B a b c Recombinaison A B c

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47 1) SouthernBlot : Transfert des fragments d'ADN sur une membrane de nylon
2) Hybridation de la membrane avec une/des sondes spécifiques

48 Hybridation avec sonde spécifique de l'ARN16S (chromosome)
Hybridation avec sonde spécifique du gène de résistance

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