Introduction.

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1 Introduction

2 Choix de la méthode Les méthodes doivent être choisi selon le:
plan technique. Paramètre d’analyse. Tenir compte de considération économique. Méthodes classique ou moléculaire. Méthodes normalisée ou pas.

3 Sur le plan technique Exactitude, mesure dont laquelle elle s’approchent de la réponse juste Précision ou absence de fluctuation autour de la moyenne Spécificité et absence de dépendance matricielle Propriété pratiques Sensibilité Limite de détection

4 Titre de la méthode ou description
Paramètre d’analyse Paramètre d’analyse Titre de la méthode ou description bactéries hétérotrophes aérobies et anaérobies (BHAA Recherche et dénombrement des bactéries hétérotrophes aérobies et anaérobies facultatives : méthode par incorporation à la gélose coliformes fécaux Recherche et dénombrement des coliformes fécaux (thermotolérants) et confirmation à l'espèce Escherichia coli : méthode par filtration sur membrane coliformes totaux Recherche et dénombrement des coliformes totaux : méthode par filtration sur membrane

5 matières résiduelles fertilisantes:
Escherichia coli matières résiduelles fertilisantes: Dénombrement de Escherichia coli : méthode par tubes multiples employant un milieu de culture à substrats enzymatiques eaux naturelles, eaux usées: Recherche et dénombrement d'Escherichia coli thermotolérant : méthode par filtration sur membrane utilisant le milieu de culture mTEC modifié Staphylococcus aureus Recherche et dénombrement de Staphylococcus aureus : méthode par filtration sur membrane

6 Méthodes normalisées Les organismes chargé de la normalisation:
La validation AFNOR Les normes des méthodes

7 Organisation chargé de la normalisation
Association française de normalisation (AFNOR). Comité européenne de normalisation (CEN). Organisation international standard (ISO).

8 Validation AFNOR L’obtention de la validation AFNOR dépend de deux étude : ·        une étude préliminaire réaliser par un laboratoire expert , consiste a comparer les résultats de la méthode de référence a la méthode rapide a valider. une étude colaborative consiste a une série des essais effectuer par au moins 8 laboratoire n’utilisant que la méthode rapide

9 Les normes NF V 08014(1984) : dénombrement des staphylocoques.
NF V 08019(1985) :dénombrement de clostridum NF V 08021(1985) dénombrement des coliformes fécaux et E C NF ISO 7954 (1988) : dénombrement des levures et moisissures NF ISO 7832 (1988): dénombrement des bacillus cereuse a 30°c NF ISO 6579 (1990): Recherche de salmonella NF ISO 4833 (1991): dénombrement des microorganismes a 30 °c : NF ISO 4832 (1991): coliformes a 30°c NF V 08017(1980) : dénombrement des coliformes fécaux et E C

10 Méthodes classiques est moléculaire
Les méthodes moléculaires : ces des méthodes : rapides et faisant appel à la biologie moléculaire. s'appuient sur les informations génétiques un grand nombre reposent sur l'amplification en chaîne par polymérase ou PCR . D'autres méthodes reposent sur la méthode dite d'hybridation ADN.

11 Méthodes classiques Le tableau précédent donne quelque méthodes classique selon le paramètre a analyser. Se qui suit on va étudier quelque méthodes d’analyse classique ces les méthodes de quantification ( dénombrement après culture).

12 Méthodes de quantification de la population contaminant Dénombrement après culture
Méthodologie générale. La démarche adapter avant chaque évaluation quantitative. Méthodes standards : Culture dans la masse du milieu gélose. Culture en surface du milieu gélose. Culture en profondeur du milieu gélose. Exploitation des résultats.

13 Méthodologie générale
elle suit la norme iso 7218 du 5 mai mettre en culture sur un milieu approprier l’aliment pour le quelle en souhaite réaliser un dénombrement, afin que les microorganismes présente dans l’inoculum introduit s’y développe, l’inoculum Le développement des microorganismes dans un milieu de culture solide donne naissance a des colonies. sont dénombrer et le résultat est exprimé en nombre de UFC Le développement de microorganismes dans un milieu liquide donne des modification visible des caractéristique du milieu,

14 La démarche adapter avant chaque évaluation quantitative.
  le nombre d’échantillon a analyser par rapport au nombre totale d’unité constituant le lot est déterminé.   le volume ou la masse de l’inoculum est déterminer. le milieu de culture doit apporter l’ensemble des nutriments nécessaire a la croissance des microorganismes a dénombrer .

15 Culture dans la masse du milieu gélose
utilisées surtout pour le dénombrement des microorganismes mésophile aérobie Les étapes de cette méthode sont : marquer les boites a pétri vide selon la concentration ( c1,c2,c3) 2.     diluer la suspension et préparer des tubes avec ces dilution. 3.     homogénéiser les tubes de dilution. 4.  a l’aide d’une pipette stérile de 1 mL transférer aseptique ment en double 1 mL de chaque dilution dans la boite a pétri .

16 couler dans la zone d’aseptie 15mL de milieu gélose, maintenu a 45° c dans chaque boite de pétri, cette Adition doit avoir lieu au plus tard 15 min après le dépôt des gouttes. , mélanger l’inoculum au milieu, par rotation délicate dans les deux sens . laisser le milieu prendre en masse : les boites sont sur une surface plan, non chaude dans la zone de stérilité , le couvercle léger ment déplacer , ne pas excédé 10 min.     une fois le milieu solidifié,retourner les boites, et les incuber dans l’étuve a la température convenable pendant le temps indiquer .       dénombrement de colonie : en surface en un aspect normal en profondeur en un aspect lenticulaire

17 Culture en surface du milieu gélose
Les étape sont les suivantes  1.     le milieu gélose est couler convenable dans les boites a pétri , marquer les selon les concentration de la suspension ( c1,c2,c3) . 2.     homogénéiser les tubes de la suspension mère et ses dilution. 3.     a l’aide d’une pipette stérile de 1 mL transférer aseptique ment en double0,1 mL de chaque dilution dans la boite a pétri. 4.     étaler l’inoculum, avec soin et rapidement , à la surface du milieu gélose , a l’aide d’un étaleur stérile, en évitent de toucher les parois de la boites. 5.     laisser sécher 15min a la température de laboratoire. 6.     incuber les boites retourner à l’étuve , a la température convenable , pendant le temps indiquer.

18 Culture en profondeur du milieu gélose
Les étapes sont les suivante :  1.     le milieu gélose est coulé en raison de 10mL en tube en verre ,il est régénérer avant d’être ensemencer et est maintenu en surfusion . 2.     l’inoculum et ses dilutions sont introduit dans des tubes a verre , l’inoculum peut être de 10mL et la suspension mère et ses dilutions de 1mL. le dénombrement de colonnes se fait en profondeur de la gélose après incubation.   

19 Exploitation des résultats
les essais ne sont validé que si ont a au moins une boites a pétri présente plus de 15 colonies . On estime qu’a UFC (unité formant colonie) correspond a un microorganisme . Le résultat final est donner en concentration en microorganismes par unité de volume ,ou de masse de la prise d’essai

20 Conclusion