METHODES DE DIAGNOSTIC VIROLOGIQUE

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1 METHODES DE DIAGNOSTIC VIROLOGIQUE
 INTERET DIAGNOSTIC: Preuve de l ’origine virale de l ’infection Suivi de l ’évolution biologique de l ’infection mise en place d’un traitement antiviral ou d’une vaccination Discussion sur le risque d’infection, de malformation et d’interruption thérapeutique de grossesse Evaluation de l ’état immunitaire d ’un patient : réponse vaccinale ou naturelle Appréciation de la réponse vaccinale Eviter la transmission de virus au cours de dons d ’organes, tissus, ou cellules. Etude du virus en cause et de ses variants : prospective vaccinale

2 Méthodes diagnostiques
Mise en évidence du virus ou de constituants viraux Culture cellulaire Biologie moléculaire Mise en évidence d’Ag viraux Diagnostic direct Infection virale Mise en évidence de la réaction immunitaire de l’hôte vis à vis d’un virus Inmmuno-diagnostic = recherche d’Ac Diagnostic indirect

3 Cinétique d’une infection virale
Défenses non spécifiques Défenses spécifiques Virus Interférons et Autres défenses non spécifiques Anticorps Titre Interféron Titre d ’anticorps ou titre viral 2 4 6 8 10 14 21 Jours

4 Prélèvements biologiques
Diagnostic direct: du virus ou des constituants: Types de prélèvements: Ecouvillonages (nez; gorge; œil; lésions; vésicules…) Liquides biologiques: Liquide céphalo-rachidien (LCR) Liquide broncho-alvéolaire (LBA) Sang; Urines; Selles;... Impératifs Nécessité d ’un transport rapide et adapté Prélèvement réalisé le plus tôt possible après le début de l ’infection Diagnostic rapide ou culture

5 Prélèvements biologiques
Diagnostic indirect: Réponse de l’hôte (Ac)  Sérodiagnostic / SERUM (sur tube sec) Signes cliniques IgG IgM Titre des anticorps 1er sérum 2ème sérum Contage J0 6 jrs 15 jrs Durée

6 Détection du virus ou des composants viraux
Diagnostic direct * Diagnostic direct: Détection du virus ou des composants viraux Isolement du virus Microscopie électronique Détection d’Ag Détection du génome Sur animaux Sur œuf embryonné Sur cultures cellulaires Effet cytopathique immunocytodiagnostic Immunocytodiagnostic ELISA Immunodiffusion (bandelettes) Latex bDNA PCR

7 Isolement sur culture ¢
Isolement du virus sur culture cellulaire:  TECHNIQUE DE REFERENCE Effet CytoPathique spécifique (ECP) Typage du virus (Entérovirus,…) Limites de la culture: Délai de réponse important Personnel spécialisé Nécessité de nombreuses lignées cellulaires Equipement de sécurité (hottes P2,P3) Prélèvements fragiles (acheminement rapide au froid) Coût

8 Techniques de diagnostic direct
Méthodes de diagnostic rapide: Immunofluorescence (IF directe ou indirecte) Anticorps spécifiques Anticorps spécifiques marqués à la fluoresceïne Anticorps secondaires Antigènes viraux IFD IFI

9 Techniques de diagnostic direct
IMMUNOFLUORESCENCE Infections respiratoires Éruptions vésiculeuses Conjonctivites Influenza; VRS Parainfluenza; HSV; CMV; Adéno HSV ; VZV HSV; CMV Virus Respiratoires Biopsies HSV; VZV Adénovirus Aspirations Lavages

10 Diagnostic indirect Techniques immuno-enzymatiques + Sérum patient
ELISA: enzyme linked immunosorbent assay  Technique très sensible et reproductible Etape 1 Antigènes viraux fixés sur une cupule + Sérum patient Etape 2 Ac fixés sur les Ag Lavages Etape 3 Fixation des Antiglobulines marquées Etape 4 Révélation + conjugué + Substrat

11 Diagnostic indirect Inhibition d’Hémagglutination + + virus hématies
Réactifs: Virus hémagglutinant (influenza; rubéole) Hématies sensibilisées Sérum du patient virus + + hématies Test POSITIF Sérum patient (Ac+)

12 Inhibition d’Hémagglutination
Diagnostic indirect Inhibition d’Hémagglutination + hématies virus Sérum patient (Ac-) Test NEGATIF

13 Immunoblot Western blot: gp160 gp120 p14 Conjugué Substrat
Lecture des bandes Membrane nitrocellulose Sérum patient

14 Techniques de biologie moléculaire
Mise en évidence du génome viral: Techniques d ’hybridation Amplification du signal: bDNA Amplification de la cible: PCR TMA (Transcription Mediated Amplification) Quantification en temps réel Etudes génotypiques: Génotypage de la souche virale: ex du VHC (LiPA; Séquençage; …) Génotypage de résistance: ex du VIH

15 Détection des acides nucléiques
TMA PCR bDNA Cible ARN ou ADN Ajouter primers & enzymes Copies (ARN) Copies (ADN) 1 sonde de détection par copie 1 sonde de détection par copie amplifiée Plusieurs sondes de détection par cible Ajouter sondes et ADN branché Virus, bactérie ou cellule