Réarrangements d’ordre supérieur de la chromatine au moment de l’activation majeure du génome embryonnaire Perrine MASSART Séminaire 10 « Topologie chromatinienne.

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1 Réarrangements d’ordre supérieur de la chromatine au moment de l’activation majeure du génome embryonnaire Perrine MASSART Séminaire 10 « Topologie chromatinienne de l’embryon précoce de mammifère » UE7 : De la fécondation à l’implantation

2 Organisation ultrastructurale de l’ADN
Définition Chromatine : substance de base des chromosomes eucaryotes, correspond à l’association ADN + histones Dans noyau interphasique Hétérochromatine : dense, ADN « inactif » Constitutive → séquences répétées autour centromère/télomère Facultative → gènes « éteints » Euchromatine : décondensée, contient les gènes actifs

3 Structures d’ordre supérieur
Compaction de la chromatine Repliements à partir de la structure en « collier de perles » ou nucléofilament Fibre de 30nm, par enroulement du nucléofilament Compactions supplémentaires : fibres de 60 à 300nm 300nm = largeur de la structure en métaphase

4 Vue globale de la compaction de l’ADN
Chromosome en métaphase Chromosome en interphase Fibre de 30 nm (Histone H1) Fibres de 11nm ou nucléofilament « Collier de perles » Nucléosome (Histones de cœur) ADN double brin

5 Activation du génome embryonnaire
Chez mammifère 1er temps : Génome de l’embryon sans activité transcriptionnelle 2ème temps : Activation du génome embryonnaire Période variable selon les espèces (tjs pré-implantatoire) Phase mineure : activité réduite, pas de Fr de transcription spécifiques Phase majeure : synthèse de transcrits en grande quantité

6 Activation du génome embryonnaire
Dépend de plusieurs facteurs : Disponibilité et activité des constituants de la « machinerie » transcriptionnelle Modifications structurales du noyau après fécondation → La réorganisation chromatinienne des génomes paternels et maternels régulerait la transcription embryonnaire = mécanisme épigénétique

7 Notion de territoires chromosomiques (CT)
Fin du XIXème : Théorie de C.Rabl → Architecture organisée et contrôlée de la chromatine en interphase Années 60 : Remise en cause par microscopie électronique → Noyau « simple enveloppe » contenant l’ADN mélangée de façon aléatoire Années 80 : FISH confirme l’existence de CT → Bien délimités, sans recouvrement par rapport aux territoires voisins

8 Topographie des CT Arrangement non aléatoires des CT
En fonction de la taille des chromosomes → Petits au centre → Grands en périphérie En fonction de la densité en gènes → Riches au centre → Pauvres en périphérie Influence de la morphologie du noyau Sphérique : la densité en gène prédomine Allongée : la taille prédomine

9 Common themes cell types specific variations of high order chromatin arrangements in the mouse
Robert Mayer, Alessandro Brero, Johan Von Hase, Tim Shroeder, Tohmas Cremer and Steffen Dietzel Ludwig-Maximilienans Universitat, München Published : 07 December 2005 BMC Cell Biology 2005, 6:44

10 Objectif de l’Etude L’arrangement des CT et des régions centromériques est-il hautement conservé dans l’évolution ? Similitudes et variations de ces arrangements entre les différents types cellulaires d’une même espèce? Modèle de la souris

11 Etudes précédentes dans le domaine
Exploiting nuclear duality of ciliates to analyse topological requirements for DNA replication and transcription. Postberg et al. J Cell Sci. 2005 Replication labelling patterns and chromosome territories typical of mammalian nuclei are conserved in the early metazoan Hydra. Alexandrova et al. Chromosoma Res. 2003 Arrangements of macro- and microchromosomes in chicken cells. Habermann et al. Chrmosoma Res. 2001 Dynamic organization of DNA replication in mammalian cell nuclei. O'Keefe RT et al. J Cell Biol. 1992 Comparative analysis of the functional genome architecture of animal and plant cell nuclei. Mayer et al. Chromosoma Res. 2003 Positionnement de la chromatine dépend du moment où elle va être répliquée en phase S (ex: si réplication précoce = position centrale)

12 Matériel étudié Etude morphologique menée sur 6 types cellulaires de souris (Mus Musculus ou MMU) - lymphocytes, fibroblastes, CSE, macrophages, myoblastes, myotubes Etude de 6 chromosomes associés par paires - MMU1/MMU14, MMU2/MMU9, MMU11/MMUX Structure 3D des noyaux conservée Cellules en phase S et en phase G0 Comparaison de la distribution des CT en fonction de la taille et de la densité en gènes dans des noyaux de formes sphériques à ellipsoïdales

13 Aspects techniques Culture cellulaire tridimensionnelle :
Nécessite l’adhésion des cellules d’intérêt sur une matrice Mise en culture de CSE, on ne conserve pour l’étude que celles qui ont un noyau sphérique Co-culture des CSE sur stroma OP9 en présence de MACSF (macrophage colony-stimulating factor) Même principe pour fibroblastes et myoblastes. Les myotubes sont obtenus par différenciation des myoblastes. Lymphocytes proviennent de sang périphérique, isolés par centrifugation + gradient de Ficoll puis mis en culture sur matrice

14 Aspects techniques Identification des cellules en phase-S (BrDU+ après min d’incubation) Fixation des cellules par formaldéhyde 4%+PBS Perméabilisation par glycérol + cycles gel/dégel pour permettre accessibilité des sonde ADN au noyau Marquage des sondes par Digoxigenine ou Biotine d’UTP qui sont révélées par Ac IIr fluorescent Travail exclusivement sur souris mâles ( pour éliminer biais du chromosome X inactif )

15 DOP-PCR Degenerate oligonucleotide primed PCR
Mise au point pour étude de cellules néoplasiques porteuses de translocations Cytogenetic analysis by chromosome painting using DOP-PCR amplified flow-sorted chromosomes, Telenius et al. 1992 Avantages → Permet l’amplification d’une séquence comportant des variants ou des inconnues par rapport à la séquence initiale. → Augmentation du « rendement » de la PCR (dispense du séquençage de l’intégralité des gènes)

16 Taille et densité en gènes des chromosomes de souris :
MMU1/14 = différence taille MAIS densité gènes identique MMU2/9 = différence de taille, densité gènes > à MMU1/14 MMU11/X = différence majeure de densité gènes

17 Résultats obtenus en FISH-3D
Marquage des chromosomes par paires Utilisation préalable de BrDU pr identifier Les cellules en phase-S Lymphocytes non stimulés et myotubes sont considérés en phase G0 (BrDU-) Analyse en microscopie confocale a, d, g, i, : MMU1/14 b, e, h, k : MMU2/19 c, f, i, l, o, n, m : MMUX/11 Images peu significatives!

18 Chaque noyau est divisé en 25 territoires
Etude menée sur 481 noyaux marqués chacun pour une paire de chromosomes Chaque noyau est divisé en 25 territoires Mesure de la quantité de signal fluorescent correspondant aux différents chromosomes dans chacun de 25 territoires Représentation de la distance séparant les chromosomes étudiés du « centre » du noyau (graph. a, d, g, j, m) Représentation de la répartition des chromosomes en fonction de leur richesse en gènes (graph.b, e, h, k, n) Représentation de la répartition des chromosomes en fonction de leur taille (graph. c, f, i, o)

19 Lymphocytes Pour le lymphocyte, on retrouve une influence significative de la densité en gènes et de la taille sur la répartition des chromosomes (p<0,001) La distribution en fonction de la densité en gènes domine (R=0,62 vs 0,32)

20 Dans les autres types cellulaires:
Aucune relation significative entre distribution des chromosomes et taille+/- richesse en gènes MAIS tendance observée: → riches en gènes au centre → petits au centre Variations d’un type cellulaire à l’autre: -Lymphocytes → influence de densité prédomine Fibroblastes et CSE → influence équivalente taille/densité -Macrophages → influence de taille prédomine

21 Influence de la forme du noyau?
Calcul de l’indice de sphéricité : (√(x*y))/z plus on s’approche de 1, plus le noyau a une forme arrondie Types de noyaux classés du plus sphérique au plus aplati: - CSE (phase-S) : 1,01 - Lymphocytes (G0) : 1,04 - Myotubes (G0) : 1,37 - Macrophages (G0) : 1,94 - Myoblastes (phase-S) : 2,75 - Fibroblastes (G0) : 3,67 - Fibroblastes (phase-S) : 4,57 Lymphocytes et CSE ont des indices ≈ identiques, pourtant variations importantes de distribution des CT

22 Eléments de discussion
Intérêts de l’article: Protocole d’expérimentation identique à celui utilisé chez l’Homme résultats comparables Chez la souris : selon le type cellulaire, taille ou densité de gènes vont alternativement dominer le processus d’organisation . Aspect novateur de l’article : Démontre la distribution des CT en fonction de la densité en gènes chez une espèce différente des primates ce phénomène semble conservé dans l’évolution Apport réel vis-à-vis des études précédentes?

23 Les questions qui restent en suspend…
Rôle prédominant taille/densité variable d’un type cellulaire à l’autre : →Ces variations ont-elles une signification fonctionnelle? L’organisation des CT en fonction de leur densité en gènes est-elle corrélée à l’activité transcriptionnelle de la cellule? →Permettrait d’expliquer les variations observées au sein d’une même lignée cellulaire en fonction du degré de différenciation N’existait-il pas chez les rongeurs, un meilleur modèle que la souris pour mener cette étude? → espèce pour laquelle les écarts taille/densité entre les chromosomes seraient plus parlants

24 Changes of higher order chromatin arrangements during major genome activation in bovine preimplantation embryos D Koehler, V Zakhartchenko, L Froenicke, G Stone, R Stanyon, E Wolf, T Cremer, A Brero Division of Anthropology and Human Genetics, Biocenter, LMU Munich Elsevier Inc. 2009

25 Objectif de l’étude L’organisation des CT dépendante de la richesse en gènes des chromosomes est-t-elle présente dès le premier stade de développement embryonnaire? Si cette organisation n’est pas présente d’emblée, à quel stade du développement apparait-elle?

26 Modèle animal choisi : bovin
Intérêt: l’activation majeure du génôme embryonnaire a lieu + tard que chez la souris → bovin = stade 8-16 cellules → souris = stade 2 cellules Ainsi, chez le bovin on peut étudier facilement: → stade pré MGA = 4-8 cellules → stade MGA = 8-16 cellules (BrDU+) → stade post-MGA = blastocyste à J6 (≈100 cellules)

27 Chromosomes étudiés Chromosomes 19 et 20, pourquoi ?
Taille ≈ identique : 63Mb vs 69 Mb Densité en gènes très différente : → 19 gènes/Mb pour chromosome 19 → 5 gènes/Mb pour chromosome 20 Cible corrélation entre distribution des CT et densité en gènes

28 Aspects techniques Culture cellulaire tridimensionnelle
Fibroblastes provenant de fœtus de bovins (BFF 451-1) Lymphocytes provenant de sang de bovins Embryons (obtenus par FIV) Ponction ovocytaire puis maturation in vitro des complexes cumulo-ovocytaires (COC) Décongélation des spz + swim up de 90 minutes Mise en contact in vitro COC + spz pendant 18h Obtention de zygotes puis mise en culture→ stade de développement embryonnaire souhaité

29 Aspects techniques Fixation des spécimens avant hybridation in situ
Cellules : formaldéhyde + cycles gel/dégel Embryons : idem mais répétition des étapes pour permettre l’accessibilité des sondes à l’ADN Préparation des sondes À partir de lignées fibroblastiques de poumon de taureau (AG 10484) Tri par FACS (Fluorescence Cell Activating Sorting) : ≈ 500 chromosomes 19 et 20 Amplification par DOP-PCR Marquage des sondes par Digoxigénine et Biotine d’UTP + fluorochrome

30 Aspects Techniques Réalisation de la FISH-3D
Compétition préalable avec DNA natif humain répétitif : pour éliminer les hybridations non spécifiques avec des séquences répétitives dispersées dans le noyau Test de spécificité des sondes : sur lignées fibroblastiques AG10484 Observation des résultats au microscope confocal

31 Distribution des chromosomes 19 et 20 dans les noyaux de fibroblastes/lymphocytes bovins
Rappel : Chromosome 19 = 19 gènes/Mb Chromosome 20 = 5 gènes/Mb Code : -1 → point le + central du noyau 0 → point le + périphérique chromosome 19 en position significativement plus interne que 20 différence de répartition plus marquée pour lymphocytes p<0,001 vs p = 0,016

32 Distribution des chromosomes 19 et 20 dans les noyaux d’embryons de bovins
Groupe 1: zygote → 4-8 cellules chromosomes 19 et 20 sont bien individualisés et répartis de façon équivalente dans le noyau Groupe 2: cellules → blastocyste chromosome 19 en position significativement plus interne que 20 phénomène + marqué dans le blastocyste c’est principalement 19 qui va se placer au centre

33 Distribution des chromosomes 19 et 20 dans les blastocystes (trophectoderme/CMI)
Blastocyste = 1ère vague de différenciation cellulaire TE → face fœtale du placenta CMI → fœtus Cette différenciation s’accompagne d’une modification morphologique des noyaux TE → noyau allongé CMI → noyau sphérique On retrouve la même répartition des chromosomes étudiés médianes équivalentes : TE = -0,51 pour CT19/-0,21 pour CT20 CMI = -0,51 pour CP19/-0,22 pour CT20

34 Proportion de noyaux ayant un phénotype « conventionnel » ou un phénotype « hollow »
2 population de noyaux dans les embryons pré-implantatoires de bovins Noyau « conventionnel » = répartition homogène de la chromatine marquée au DAPI Noyau « hollow » = répartition très hétérogène avec signal DAPI très faible Au cours du développement embryonnaire la proportion de phénotype « hollow » va diminuer Existe-t-il une corrélation entre l’absence d’organisation des CT en fonction de la densité en gènes dans les embryons pré-MGA et la forte proportion de noyaux ayant un phénotype hollow à ce stade?

35 Distribution des CT 19 et 20 dans les embryons 4-8 cellules et 10-16 cellules en fonction du
phénotype nucléaire Quel que soit le phénotype nucléaire, la répartition centre/périphérie des CT 19 et 20 s’opère au stade 8-16 cellules chez les bovins Absence de relation directe entre le phénotype nucléaire et l’organisation des CT en fonction de la densité génique

36 Eléments de discussion
Intérêt de l’étude: Démontre la répartition des CT en fonction de la densité génique chez le bovins argument supplémentaire pour affirmer qu’il s’agit d’un processus hautement conservé dans l’évolution La répartition en fonction de la densité génique est plus marquée dans cellules à noyau sphérique Cohérent avec données de la littérature chez l’humain Non-random radial higher-order chromatin arrangements in nuclei of diploid human cells ,Cremer et al.

37 Eléments de discussion
Intérêt de l’étude : Apport de la FISH-3D : observation des chormosomes au sein de noyaux embryonnaires dont la structure 3D est respectée L’organisation de la chromatine en fonction de la densité génique s’opère lors de la MGA et se poursuit jusqu’au stade blastocyste

38 Questions en suspend Quel est le rôle fonctionnel de cette répartition topographique? Données de la littérature : Corrélation entre distribution des CT et chronologie de réplication de la chromatine Mapping replicational sites in the eucaryotic cell nucleus, Nakayasu et al. MAIS cette distribution est respectée même en l’absence d’activité transcriptionnelle de la cellule Exploiting nuclear duality of ciliates to analyse topological requirements for DNA replcation and transcription, Potsberg et al.

39 Questions en suspend Concernant l’association répartition des CT et MGA: S’agit-il d’une simple coïncidence chronologique? La MGA provoque-t-elle l’organisation des CT? L’organisation des CT permet elle la MGA ? Etude en cours : Comment s’opère la répartition des CT dans des noyaux embryonnaires où l’on bloque la MGA ?

40 Questions en suspend Concernant le phénotype nucléaire « hollow »
S’agit-il d’un artéfact de préparation? → Etapes de dénaturation favorisent la dispersion de l’ADN → Phénotype observé dans cellules préparées pour l’immunohistochimie (= sans dénaturation d’ADN) Quel rôle fonctionnel attribuer à ce phénotype? → S’agit-il d’un noyau où les espaces inter-chromatiniens sont anormalement grands? → S’agit-il d’un noyau porteur d’aberrations chromosomiques dans une cellule en cours d’apoptose? Ainsi, la faible proportion de « hollow » dans les blastocystes serait le reflet d’une sélection des embryons haploïdes