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Biologie Moléculaire des Hépatites Virales Bases Théoriques.

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1 Biologie Moléculaire des Hépatites Virales Bases Théoriques

2 QCM 1 GENOME HEPATITE B ADN linéaire bicaténaire contenu dans une nucléocapside ARN linéaire monocaténaire de polarité positive ADN circulaire partiellement double brin il existe plusieurs cadres de lecture ouverte il existe un seul cadre de lecture ouverte code pour 6 protéines

3 QCM 2 STRUCTURE DE LARN Structure en double hélice Le sucre contenu dans le squelette de pentoses et de phosphate est le desoxyribose Les bases azotées contenues dans lARN sont identiques à celles de lADN Dans lARN, les bases azotées sapparient 2 à 2, adénine avec thymine et cytosine avec guanine Luracile est une base contenue dans lARN

4 QCM 3PCR ET RT-PCR Technique qui permet de doubler la quantité dADN à chaque cycle La RT-PCR est une technique plus sensible que la PCR La préparation de lADN est plus délicate que celle de lARN Pour lARN, une étape supplémentaire est nécessaire à la réalisation de la technique Possibilité de travailler dans une seule et unique pièce si on décontamine le matériel à la javel

5 QCM 4 Tm ET SONDE La Tm est caractéristique dune molécule dADN donnée La Tm ne dépend que du pourcentage en guanine contenu dans lADN La Tm est la température à laquelle lADN est complètement dénaturé Une sonde dhybridation permet de détecter nimporte quel ADN Le choix de la sonde doit se faire en fonction de sa Tm et de celle des amorces

6 QCM 5 SEQUENCAGE ET SYNTHESE PROTEIQUE Chaque nucléotide correspond à un acide aminée Chaque triplet de nucléotide correspond à un acide aminée différent Un codon est constitué de trois nucléotides Le code génétique est dit dégénéré La mutation de trois nucléotides est nécessaire pour entraîner la modification dun acide aminée Le séquençage dun ADN nécessite de faire une PCR

7 GENOME DU VIRUS DE LHEPATITE C ARN linéaire simple brin de polarité positive de 9.6 kb 3 régions distinctes: région 5 non codante, un cadre de lecture ouverte unique, et la région 3 non codante

8 GENOME DU VIRUS DE LHEPATITE B ADN circulaire, double brin sur 2/3 de sa longueur Code pour 4 gènes: gène S (AgHBs) gène C (AgHBc, AgHBe) gène P (ADN polymérase) gène X (protéine HBX)

9 STRUCTURE ARN/ADN

10 REPLICATION DE LADN REPRESENTATION SCHEMATIQUE Reproduction du génome (ADNpolymérase…) Possibilité derreur dans la reproduction: apparition de mutations

11 APPLICATION AU LABORATOIRE: LA PCR – LA RT-PCR PCR: Virus à ADN (HBV) Réactifs: Taq Polymerase, dNTPs, amorces spécifiques RT-PCR: Virus à ARN (HCV) 95°C Dénaturation 50°C-60°C Hybridation des amorces 72°C Elongation ADN ARN Réactifs: Reverse transcriptase, Taq Polymerase, dNTPs, amorces spécifiques UN CYCLE DE PCR Reverse Transcription ADNc Hybridation de lamorce ElongationDénaturation Hybridation des amorces et élongation

12 INSTABILITE DE LARN / LADN plus facilement dégradable Préparation de lARN : étape délicate (Rnases, présence éventuelle dADN) Attention aux contaminations: différenciation des pièces de travail (pièce « tampon », pièce « pré-ampli », pièce « post-ampli » décontamination du plan de travail et de tout le matériel utilisé pour manipuler à la javel PRECAUTIONS A PRENDRE POUR LA MANIPULATION DE LARN

13 DETECTION DES PRODUITS PCR: HYBRIDATION DE SONDE - PRINCIPE La température de fusion Tm est la température à laquelle 50% de lADN est dénaturé (simple brin)

14 CALCUL DE LA TEMPERATURE DE FUSION (Tm) La Tm est caractéristique dune molécule dADN donnée Pour la réalisation dune PCR, le choix des amorces et de la (ou les) sonde(s) se fait Tm dépendant Oligonucléotide inférieur à 20 nt Tm (en °C) = (A+T)x2 + (G+C)x4 Oligonucléotide supérieur à 20 nt Tm (en °C) = [(A+T)x2 + (G+C)x4] x (1 + [(N-20)/20])

15 SONDE HYBRIDEE A chaque cycle, la fluorescence augmente proportionnellement à la quantité dADN produit.

16 EXPRESSION DU GENOME: SYNTHESE DES PROTEINES TRADUCTION Chaque triplet de bases ADN code pour un triplet de bases ARN (codon). Un codon code pour un acide aminé.

17 Le code génétique Un codon START (AUG) donne le signal du début de séquence. Trois codons STOP (UAA, UAG, UGA) stoppe la synthèse protéique Le code génétique est dit dégénéré:

18 APPLICATION AU LABORATOIRE Séquençage - Principe CCAGGAAGATGG CCAGGAAGATG CCAGGAAGAT CCAGGAAGA CCAGGAAG CCAGGAA CCAGGA CCAGG CCAG CCA CC C + Réalisation dune PCR avec un mélange de dNTPs et de ddNTPs (blocage de la synthèse dADN). Chaque ddNTP est marqué avec un fluorochrome spécifique. Après la PCR, migration sur gel pour séparer les brins en fonction de leur taille et lecture de la séquence en fonction des couleurs de la fluorescence émise

19 APPLICATION AU LABORATOIRE Séquençage – exemple de lhépatite B Les mutants précore : Absence dAgHBe TRP GLY Souche sauvage : T-T-T-G-G-G-G-C STOP GLY Mutant M1 : T-T-T-A-G-G-G-C STOP ASP Mutant M2 : T-T-T-A-G-G-A-C -1901

20 APPLICATION AU LABORATOIRE Séquençage – exemple de lhépatite B La mutation YMDD sur la polymérase (position 204): résistance au traitement à la lamivudine Y M D D Souche sauvage : - T-T-A-T-A-T-G-G-A-T-G-A-T-G- Y I D D Mutant YIDD: - T-T-A-T-A-T-A-G-A-T-G-A-T-G- Y V D D Mutant YVDD: - T-T-A-T-G-T-G-G-A-T-G-A-T-G-

21 QCM 1 GENOME HEPATITE B ADN linéaire bicaténaire contenu dans une nucléocapside ARN linéaire monocaténaire de polarité positive ADN circulaire partiellement double brin il existe plusieurs cadres de lecture ouverte il existe un seul cadre de lecture ouverte code pour 6 protéines

22 QCM 2 STRUCTURE DE LARN Structure en double hélice Dans lARN, les bases azotées sapparient 2 à 2, adénine avec thymine et cytosine avec guanine Le sucre contenu dans le squelette de pentoses et de phosphate est le desoxyribose Les bases azotées contenues dans lARN sont identiques à celles de lADN Luracile est une base contenue dans lARN

23 QCM 3PCR ET RT-PCR Technique qui permet de doubler la quantité dADN à chaque cycle La RT-PCR est une technique plus sensible que la PCR La préparation de lADN est plus délicate que celle de lARN Pour lARN, une étape supplémentaire est nécessaire à la réalisation de la technique Possibilité de travailler dans une seule et unique pièce si on décontamine le matériel à la javel

24 QCM 4 Tm ET SONDE La Tm est caractéristique dune molécule dADN donnée La Tm ne dépend que du pourcentage en guanine contenu dans lADN La Tm est la température à laquelle lADN est complètement dénaturé Une sonde dhybridation permet de détecter nimporte quel ADN Le choix de la sonde doit se faire en fonction de sa Tm et de celle des amorces

25 QCM 5 SEQUENCAGE ET SYNTHESE PROTEIQUE Chaque nucléotide correspond à un acide aminée Chaque triplet de nucléotide correspond à un acide aminée différent Un codon est constitué de trois nucléotides Le code génétique est dit dégénéré La mutation de trois nucléotides est nécessaire pour entraîner la modification dun acide aminée Le séquençage dun ADN nécessite de faire une PCR


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