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Transcription in vitro : principe et applications MEB MANO Jordi – L3 Biologie Santé

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Présentation au sujet: "Transcription in vitro : principe et applications MEB MANO Jordi – L3 Biologie Santé"— Transcription de la présentation:

1 Transcription in vitro : principe et applications MEB MANO Jordi – L3 Biologie Santé

2 Principe Utilisation des principes de la transcription in vivo dans un système hors-cellule. ADN à transcrire sous forme de plasmide généralement. Promoteurs forts utilisés : Bactériophages T7, T3 ou SP6. Daprès In vitro transcription and translation, Genetics Wiki.

3 Matériel nécessaire ADN plasmidique : – Séquence dintérêt (ADNc) – 2 promoteurs opposés (T7 ou autre) – Un site de restriction unique dans chaque promoteur – Pas de terminaison nécessaire ADN polymérase(s) spécifique(s) du promoteur Solutions de ribonucléosides triphosphates Autres : tampon (Mg 2+,…), DNaseI, milieu sans RNase,… Daprès Principes de génie génétique Exemple du plasmide LITMUS (Evans et al., 1995)

4 Applications Traduction in vitro Protection à la RNase Détermination de protéines se fixant à lARN Synthèse dARN antisens et siRNA Micro-injections Synthèse de sondes dhybridation : – Puces à ADN – Blotting – Hybridation in situ

5 Synthèse de sondes ARN Daprès Principes de génie génétique Exemple du plasmide LITMUS (Evans et al., 1995) Activité des promoteurs malgré la présence des sites de restriction Transcription dans le sens désiré : digestion par une des deux enzymes de restriction avant transcription Marquage de la « ribosonde » possible et facilité par la linéarisation du plasmide (haptènes, isotopes radioactifs,etc.)

6 Exemple dutilisation de sondes ARN Cas de lhybridation in situ Daprès Developmental Biology 9e Online 1)Transcription de la ribosonde marquée à la digoxigénine (Dig) 2)Hybridation avec lARNm cible 3)Lavage-élimination hybrides non spécifiques 4) Ajout dun anti-corps anti Dig couplé à une phosphatase alcaline 5) Lavage 6) Réaction enzymatique et coloration

7 Avantages/Inconvénients Avantages Grandes quantités dARN synthétisées Rapide Marquage au cours de la synthèse Sondes très marquées: activité spécifique élevée Sondes sens et anti-sens Hybridation très stable (ARN/ADN ou ARN/ARN) Inconvénients Grande taille de la sonde : pénétration difficile dans le cas de lhybridation in situ Hybridation à haute température Sensibilité aux RNases : préparation et stockage plus difficiles


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