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Les techniques de la biologie moléculaire. IntroductionIntroduction.

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1 Les techniques de la biologie moléculaire

2 IntroductionIntroduction

3 "Chercher une aiguille dans une meule de foin" ? Chercher à repérer un gène particulier dans un génome entier, qui en contient jusqu'à des centaines de milliers, c'est un peu comme chercher une aiguille dans une meule de foin...

4 La réponse a ce problème : Les techniques de la biologie moléculaire

5 LélectrophorèseLélectrophorèse

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7 Lélectrophorèse des acides nucléiques Déplacements de fragments dacides nucléiques chargés selon leur taille sur un gel soumis a un champ électrique

8 Le gel utilisé Lagarose pour les fragments dADN de taille (0,5-20kb) Lacrylamide pour les fragments de moins de 1000 paires de base

9 Lélectrophorèse en champs alternées Principe On change périodiquement lorientation du champ par a port au gel,lors du changement de lorientation du champ électrique lacide nucléique change le sens de son orientation.

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12 Visualisation par autoradiographie

13 But Séparer, analyser ou purifier des acides nucléiques

14 Remarque Les fragments dacides nucléiques peuvent être séparer selon leur structure ;par exemple les différents formes dun plasmide (ouvert,linéaire,surenroulé)

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16 Remarque Elle permet aussi détudier des interactions des acides nucléiques avec des protéines

17 La centrifugation

18 Centrifugation en gradient de saccharose Principe: Séparer les macromolécules selon leur poids moléculaire et/ou leur forme

19 Utilisations majeurs Purification des phages Sélection des fragments dADN voulus Isolement des polysomes Fractionner les ARN (ARNm, ARNt,…)

20 Un exemple d'utilisation de la centrifugation zonale : le fractionnement de molécules d'ARN

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22 Centrifugation en gradient de chlorure de césium 1./Centrifugation isopycnique (gradient continu) Utilisation dune: Solution de chlorure de césium(CsCl)

23 Utilisations majeurs Préparation de plasmides et de phages Exemple: La purification des plasmides

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25 2/.Centrifugation sur coussin (gradient discontinu)

26 Utilisation majeure préparation rapide et à grande échelle des phages ou des virus de densité connue.

27 Un exemple d'utilisation de la centrifugation sur coussin : la purification des phages

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29 La PCR

30 Historique En 1960 dans les sources de Yellowstone aux U.S.A. « Thermus aquaticus » est découverte vivant à 70°C, trente ans plus tard son ADNpoly est utilisée dans la PCR ( La revue Sciences décernait sa 1ere distinction de molécule de lannée à la Taq polymérase)

31 Définition PCR « polymérase chain reaction ») technique damplification in vitro mis au point par le chimiste Kary MULLIS en 1985 ( Prix Nobel 1993)

32 Principe Faire progresser nos capacité danalyse des gènes

33 Composés utilisés LADN matrice Amorces doligonucléotides Une ADN polymérase Des désoxyribonucléotides triphosphate (dNTP)

34 Déroulement des cycles damplification La dénaturation Lappariement des primers Elongation Schéma de la PCR

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36 Applications La PCR a apportée dimportantes contributions dans beaucoup de domaines: Les maladies héréditaires La recherche contre le cancer Les sciences médico-légales Les biotechnologies

37 LhybridationLhybridation

38 Généralités Les techniques de lhybridation reposent sur : Complémentarité des bases successives de lADN La réversibilité du processus de séparations deux brins dADN

39 Les cas possibles pour une hybridation 1.Hybridation stable (100%) 2.Pas dhybridation 3.Hybridation partielle (50%)

40 But Repérer une molécule dADN ou dARN spécifique dans une population hétérogène

41 Les différentes techniques dhybridation Hybridation ADN/ADN : Southern blotting Hybridation ARN/ADN : Northern blotting Hybridation Dot-blotting et slot- blotting

42 Southern Sonde ADN Cible ADN (nucléaire, phagique plasmidique ou autres,…)

43 Northern Sonde ADN Cible ARN

44 Dot-blotting & Slot- blotting Sonde ADN Cible ARN ou ADN Monocaténaire

45 Conclusion Grace aux techniques de la biologie moléculaire les chercheurs ont pu établir une partie de la carte des gènes humains, et espèrent obtenir le séquençage de tous le génome humain a des fins thérapeutique, médicales, a titre de prévention

46 Référence *Cours de linstitut national de recherche pédagogique *Biologie moléculaire PCEM Université de Paris –VI Faculté de Médecine Pierre et Marie Curie *Comprendre la biologie moléculaire V. Laudenbach, (2), J. Mantz(1), J.M. Desmontsl(1) (1) Département danesthésie-réanimation chirurgicale, hôpitaux Bichat-Claude Bernard-Robert Paris ; (2)Laboratoire de neurologie du développement Paris * Thèse de Licence dinformatique Année Option : Introduction à la biologie moléculaire *Principes des techniques de biologie moléculaire 2° édition Par D. Tagu, C.Moussard, éds (I.N.R.A. de Paris) *Article du magazine La recherche édition spéciale N°317 Février 1999 * Participation à létablissement dune phylogénie moléculaire de requins deau profonde de lordre des Squaliformes de LUniversité de Nantes Département Sciences et Techniques Alimentaires Marines *Lessentiel en génétique Edition : BERTI *Biochimie génétique biologie moléculaire de Jacqueline Etienne & Eric Clauser Edition Masson *Principe de génie génétique 6° édition ; édition De Boeck


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