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TD N°1:TECHNIQUES DE SEPARATION ET DANALYSE DES ACIDES NUCLÉIQUES: ADN, ARN & PLASMIDES Faculté des Sciences Rabat Faculté des Sciences Rabat Laboratoire.

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1 TD N°1:TECHNIQUES DE SEPARATION ET DANALYSE DES ACIDES NUCLÉIQUES: ADN, ARN & PLASMIDES Faculté des Sciences Rabat Faculté des Sciences Rabat Laboratoire de Microbiologie et Biologie Moléculaire Laboratoire de Microbiologie et Biologie Moléculaire Filière SVI – S6 Module de Génétique et Biologie Moléculaire Elément 2: Biologie Moléculaire

2 TD1.TECHNIQUES DE SEPARATION ET DANALYSE DES ACIDES NUCLÉIQUES 2 Connaître les principes des techniques de base de la biologie moléculaire. Savoir décrire les procédés employés et leur utilité. Connaître les outils utilisés dans ces techniques. Savoir analyser les résultats de ces techniques.

3 1.1.Extraction des ADN 1.2.Extraction des ARN 1.3.Extraction des plasmides Rappel sur les plasmides Purification par Lyse alcaline Purification par Gradient de chlorure de césium 1.Purification des acides nucléiques 2.Séparation des acides nucléiques 3.Elaboration de Cartes de restrictions des plasmides 2.1.Electrophorèse sur gel dagarose 2.2.Electrophorèse sur gel de polyarylamide

4 TD1.TECHNIQUES DE SEPARATION ET DANALYSE DES ACIDES NUCLÉIQUES 4 =technique permettant d'isoler l'ADN de cellules ou de tissus. L'ADN extrait digestion, hybridation (Southern blot), séquençage, PCR, clonage… Différents protocoles pour extraire l'ADN avec même schéma de principe : 1.Purification des acides nucléiques 1.1.Extraction de lADN Lyse des cellules Elimination des protéines Elimination des autres acides nucléiques (ARN...) Concentration de l'ADN par précipitation à l'alcool

5 TD1.TECHNIQUES DE SEPARATION ET DANALYSE DES ACIDES NUCLÉIQUES 5 Différentes variantes employées: l'ADN génomique (issu du ou des chromosomes des cellules analysées) Ou l'ADN plasmidique (provenant de plasmides portés le plus souvent par des cellules bactériennes comme Escherichia coli ). Kits commerciaux extractions rapides à l'aide de réactifs prêts à l'emploi.

6 TD1.TECHNIQUES DE SEPARATION ET DANALYSE DES ACIDES NUCLÉIQUES 6 lyse des cellules ou des tissus =broyage ou pas + extraction/détergents disperser les bicouches lipidiques des membranes dénaturer les protéines srtt celles associées à l'ADN dans la chromatine déprotéinisation de la solution =extraction / solvants organiques, en général du phénol +/-chloroforme protéines dénaturées précipité à l'interface phénol-eau = « gâteau » l'ADN en solution dans la phase aqueuse Pour éliminer les ARNs Traitement par lARNase. Solution très visqueuse l'ADN : très longs filaments s'opposant aux écoulements hydrodynamiques. Préparation d'ADN génomique LADN collecté/centrifugation dissous dans Tampon ou Eau pure. précipitation de lADN =addition d'éthanol ou d'isopropanol dans la phase aqueuse

7 TD1.TECHNIQUES DE SEPARATION ET DANALYSE DES ACIDES NUCLÉIQUES 7 tampon sans pression osmotique, faisant éclater les membranes fermées EDTA inhibe les nucléases en chélatant les ions Mg++ & Ca++ SDS dénature les lipoprotéines membranaires et les enzymes lysosomiales et libère ainsi l'ADN tout en préservant sa structure.

8 TD1.TECHNIQUES DE SEPARATION ET DANALYSE DES ACIDES NUCLÉIQUES 8 Phénol = agent déprotéinisant

9 TD1.TECHNIQUES DE SEPARATION ET DANALYSE DES ACIDES NUCLÉIQUES 9 Pour éliminer les traces de phénol et d'autres contaminants (prot., enz…) dialyse ou purification par chromatographie en colonne de gel dénaturant ou d'adsorption. Ethanol mobilise leau du milieu & diminue la solubilité de lADN

10 TD1.TECHNIQUES DE SEPARATION ET DANALYSE DES ACIDES NUCLÉIQUES 10 SPECTROPHOTOMETRIE à UV QUANTITE DE LADN: DO260nm =1 correspond à 50 ng/μL dADN Total QUALITE DE LADN: Abs260/Abs280 nm QUANTITE & QUALITE DE LADN: Electrophorèse sur gel dagarose

11 TD1.TECHNIQUES DE SEPARATION ET DANALYSE DES ACIDES NUCLÉIQUES 11 ASPECT DE L'ADN GENOMIQUE SUR GEL DAGAROSE ADN natif non digéré

12 TD1.TECHNIQUES DE SEPARATION ET DANALYSE DES ACIDES NUCLÉIQUES 12 =technique permettant d'isoler lARN de cellules ou de tissus. LARN extrait hybridation (Northern blot), banques ADNc, RT-PCR… Différents protocoles pour extraire lARN avec même schéma de principe : Lyse cellulaire mécanique (congélation, billes de céramique ou détergents) ou enzymatique (lysozyme ou la lyticase)+Protection des ARN de laction des ARNases. 2 grands principes: 1) les différences de propriétés physico-chimiques ARN/protéines ; 2) ladsorption sélective des ARN sur support solide. 1.1.Extraction de lARN

13 +Phénol/Chlrf accélérer la procédure dextraction (++ieurs séries/- cellules) TD1.TECHNIQUES DE SEPARATION ET DANALYSE DES ACIDES NUCLÉIQUES 13 Pour extraire l'ARN d'un tissu ou d une suspension de cellules, il faut impérativement inhiber toute trace d ARNase. GuSCN: agent puissant de dénaturation des protéines:Lyse beta2-mercaptoéthanol :rupture des ponts disulfures protéiques

14 TD1.TECHNIQUES DE SEPARATION ET DANALYSE DES ACIDES NUCLÉIQUES 14 se caractérisent par la présence du côté 3'-terminal d'une longue queue poly(A) synthétisée à la phase post- transcriptionnelle. Parmi les acides ribonucléiques extraits des cellules les ARN messagers = ARNm = classe la plus étudiée chromatographie d'affinité entre cette queue poly(A) et une colonne dont la phase fixe est pourvue de fragments d'oligo(dT) de quelques dizaines de nucléotides qui peuvent s'hybrider avec les RNA poly(A). PURIFICATION

15 TD1.TECHNIQUES DE SEPARATION ET DANALYSE DES ACIDES NUCLÉIQUES 15

16 TD1.TECHNIQUES DE SEPARATION ET DANALYSE DES ACIDES NUCLÉIQUES 16 SPECTROPHOTOMETRIE à UV QUANTITE DE LARN: DO260nm =1 correspond à 40 ng/μL dARN Total QUALITE DE LARN: Abs260/Abs280 nm QUANTITE & QUALITE DE LARN: Electrophorèse sur gel dagarose

17 ASPECT DES ARN SUR GEL DAGAROSE TD1.TECHNIQUES DE SEPARATION ET DANALYSE DES ACIDES NUCLÉIQUES 17 Marqueur de PM (1kb) ARN totaux dégradés ARN totaux non dégradés

18 18 Petites molécules dADN habituellement circulaire Existant indépendamment des chromosomes de lhôte Présents chez nombreuses bactéries (qques levures et mycètes) A réplication autonome (=réplicons) indépendamment des chromosomes Portent un nombre de gènes très réduit (30) A information génétique non-essentielle pour lhôte En nbr. variable: 1.3.Extraction des plasmides Les plasmides: Rappel Plasmide à copie unique (1 seul/cellule hôte) Plasmides à copies multiples (40 ou + /cellule hôte)

19 TD1.TECHNIQUES DE SEPARATION ET DANALYSE DES ACIDES NUCLÉIQUES 19 Les plasmides peuvent être éliminés des cellules hôtes=CURAGE (curing) Spontané/Induit Principe: traitements inhibant la réplication des plasmides sans affecter la reproduction des cellules hôtes Plasmides inhibés progressivement & dilués au cours de la multiplication bactérienne Méthodes de curage: Mutagènes dérivés de lacridine Radiations UV ou ionisantes Privation de thymine Températures supra-optimales

20 TD1.TECHNIQUES DE SEPARATION ET DANALYSE DES ACIDES NUCLÉIQUES 20 Différentes formes d'un plasmide L'axe de la double hélice d'ADN peut lui-même s'enrouler en une super hélice droite ou gauche. Cette forme superenroulée de l'ADN joue un rôle biologique très important (compaction, stabilité de l'ADN). Une coupure sur un seul des deux brins d'ADN superenroulé (forme I) déverrouille la superhélicité et permet le relâchement spontané de la molécule sous forme circulaire ouverte (forme II). La réparation de cette coupure par une ligase produit une forme circulaire fermée (forme Ir). Une coupure sur les deux brins d'une molécule superenroulée ou d'une molécule circulaire fermée produit une molécule linéaire (forme III).

21 TD1.TECHNIQUES DE SEPARATION ET DANALYSE DES ACIDES NUCLÉIQUES Purification par Lyse alcaline Parmi les techniques les plus courantes de la biologie moléculaire = noms abrégés: miniprep, midiprep et maxiprep (volume de la culture bactérienne). Préparation sélective de l'ADN du plasmide contenu dans les bactéries, tout en éliminant l'ADN du chromosome bactérien. Différentes variantes ou améliorations de cette méthode existent kits commerciaux (grd nbr) avec petites colonnes de résine chromatographique échangeuse d'ion améliorer la pureté de l'ADN. BUT : Extraire de façon rapide l'ADN plasmidique afin de l'analyser avec des enzymes de restriction et électrophorèse en gel d'agarose. Obtenir plusieurs mg d'ADN partiellement purifié et Réaliser plusieurs digestions enzymatiques pour vérifier un clone, ou établir une carte de restriction.

22 TD1.TECHNIQUES DE SEPARATION ET DANALYSE DES ACIDES NUCLÉIQUES 22 Suspension de lADN plasmidique dans TE ou Eau pure Elimination des ARN/ribonucléases (hydrolyse sélective des ARN/ ADN intact) Concentration de l'ADN plasmidique par précipitation à l'alcool Récupération de lADN par centrifugation Neutralisation rapide /acétate de potassium (pH 5,5) Renaturation de lADN plasmidiquePrécipitation de lADN Chromosomique Lyse des cellules /détergent (SDS) en présence de soude (pH 13) Dénaturation de l'ADN total Préparation d'ADN plasmidique TECHNIQUE A REALISER EN TP

23 TD1.TECHNIQUES DE SEPARATION ET DANALYSE DES ACIDES NUCLÉIQUES Purification par Gradient de chlorure de césium = technique basée sur la centrifugation en gradient de densité. PRINCIPES DE BASE La centrifugation = méthode couramment utilisée en biochimie pour séparer ou analyser des fractions ou des structures cellulaires, des macromolécules, etc. On peut accentuer ou raffiner les méthodes de séparation en faisant cette centrifugation dans un gradient de concentration: On peut donc moduler cette vitesse en faisant varier de façon continue ou par étape (discontinue) cette différence de densité en créant un gradient de concentration. la différence entre la densité de la particule et celle du solvant influence la vitesse de sédimentation.

24 TD1.TECHNIQUES DE SEPARATION ET DANALYSE DES ACIDES NUCLÉIQUES 24 Comment? Densité de la particule > celle du milieu La particule sédimente Densité de la particule = celle du milieu La particule ne sédimente pas Densité de la particule < celle du milieu La particule sélève flotte

25 TD1.TECHNIQUES DE SEPARATION ET DANALYSE DES ACIDES NUCLÉIQUES 25 Les variations de densités sont obtenues en faisant varier la concentration d'un produit chimique dans la solution. Divers produits peuvent être utilisés pour faire ces gradients: Ils doivent être: très solubles en solution aqueuse des densités suffisantes. inertes, peu coûteux, faciles à manipuler, non toxiques, etc. Fabrication des gradients

26 TD1.TECHNIQUES DE SEPARATION ET DANALYSE DES ACIDES NUCLÉIQUES 26 Le produit couramment utilisé, particulièrement dans la séparation des acides nucléiques: le chlorure de césium (CsCl). Ce sel peut atteindre une densité très élevée, de l'ordre de 1.9 g/mL à 7.5 mol/L. Cette possibilité d'atteindre des densités si élevées en solution aqueuse est son principal avantage.

27 TD1.TECHNIQUES DE SEPARATION ET DANALYSE DES ACIDES NUCLÉIQUES 27 Gradients discontinus La juxtaposition un par-dessus l'autre des solutions ayant des différences suffisantes de densités. Gradients continus La variation de densité est graduelle le long du tube à centrifuger.

28 TD1.TECHNIQUES DE SEPARATION ET DANALYSE DES ACIDES NUCLÉIQUES 28 Purification sur gradient de Chlorure de Césium

29 TD1.TECHNIQUES DE SEPARATION ET DANALYSE DES ACIDES NUCLÉIQUES 29 2.Séparation des acides nucléiques La technique la plus utilisée pour la séparation des acides nucléiques: Lélectrophorèse Principe général: Dans un milieu donné, la séparation des particules se fait en fonction de leur charge électrique et pour des charges identiques, en fonction de leur taille.

30 TD1.TECHNIQUES DE SEPARATION ET DANALYSE DES ACIDES NUCLÉIQUES 30 ELECTROPHORESE DE LADN Cette technique est assez simple à mettre en œuvre si on dispose des bons outils et de quelques astuces. = technique de biologie moléculaire séparer des fragments dADN de différentes tailles en les faisant migrer dans un gel en les soumettant à un courant électrique. Le gel est constitué d'une matrice de polymère baignant dans un tampon conducteur. Deux principaux polymères sont utilisés : l'agarose et le polyacrylamide.

31 TD1.TECHNIQUES DE SEPARATION ET DANALYSE DES ACIDES NUCLÉIQUES 31 Principe: basée sur la séparation des acides nucléiques chargés négativement à pH 7~8, vers l'anode (+) sous l'effet d'un champ électrique. Cette séparation s'effectue à travers la matrice du gel en fonction de la taille des molécules.

32 TD1.TECHNIQUES DE SEPARATION ET DANALYSE DES ACIDES NUCLÉIQUES 32 Electrophorèse dADN

33 TD1.TECHNIQUES DE SEPARATION ET DANALYSE DES ACIDES NUCLÉIQUES 33 Estimation du poids moléculaire de fragments d'ADN après une digestion par des enzymes de restriction Analyse d'ADN ou d'ARN après une amplification par PCR Séparation de fragments dADN digérés avant Southern blot ou d'ARN dans le cas de Northern Blot. Les applications de lélectrophorèse de lADN

34 TD1.TECHNIQUES DE SEPARATION ET DANALYSE DES ACIDES NUCLÉIQUES 34 électrophorèse sur gel de polyacrylamide (ou PAGE pour Poly-Acrylamide Gel Electrophoresis) ; électrophorèse en gel d'agarose ; focalisation isoélectrique (électrophorèse dans un gradient de pH) ; électrophorèse bi-dimensionnelle ; électrophorèse en champ pulsé ; Immunoélectrophorèse (pour détecter une interaction antigène/anticorps) ; Il existe de nombreux types d'électrophorèses, dont :

35 TD1.TECHNIQUES DE SEPARATION ET DANALYSE DES ACIDES NUCLÉIQUES 35 L'agarose est utilisé à des concentrations de 0,5% à 2% (poids/volume) et permet de séparer des molécules de très grande taille, principalement de l'ADN ou de l'ARN ; Lagarose = polymère à base d'agar purifié. Différentes puretés d'agarose sont disponibles. En général, de l'agarose de grande pureté à solidification lente est utilisé lorsque l'ADN doit être extrait du gel après migration. 2.1.Electrophorèse sur gel dagarose

36 TD1.TECHNIQUES DE SEPARATION ET DANALYSE DES ACIDES NUCLÉIQUES 36 Pouvoir de séparation d'ADN linéaire, double brin, selon la concentration d'agarose du gel

37 TD1.TECHNIQUES DE SEPARATION ET DANALYSE DES ACIDES NUCLÉIQUES 37 Le pouvoir de résolution dun gel dagarose dépend du % dagarose. Il peut varier de 0,5 à 2%

38 TD1.TECHNIQUES DE SEPARATION ET DANALYSE DES ACIDES NUCLÉIQUES 38 Le gel dagarose nest pas résolutif pour de petits fragments dADN (Inférieurs à 100 pb)

39 TD1.TECHNIQUES DE SEPARATION ET DANALYSE DES ACIDES NUCLÉIQUES 39 Un gel d'agarose avant éclairage sous ultraviolets Puits : 1. Echelle de marqueur de poids moléculaire (1kbplus) 2. vide, 3. Un produit de PCR d'une taille légèrement supérieure à 500 paires de bases 4. Fragment d'environ 4.5kb d'un Plasmide digéré par une enzyme de restriction Le gel est exposé à des rayonnements ultraviolets, le BET colore l'ADN en une couleur rouge-orangée Photographie du gel

40 TD1.TECHNIQUES DE SEPARATION ET DANALYSE DES ACIDES NUCLÉIQUES 40 Le bromure d'éthidium (EtBr) = à la fois un agent intercalant et un fluorochrome. Structure aromatique plane s'intercaler entre les paires de bases détorsion de la double hélice et émission de lumière (fluorescence) dans le rouge-orange lorsque le complexe ADN-EtBr est excité en lumière utraviolette. C'est l'une des principales méthodes de détection de l'ADN dans les gels d'électrophorèse. Formule du bromure d'éthidium

41 TD1.TECHNIQUES DE SEPARATION ET DANALYSE DES ACIDES NUCLÉIQUES 41 préparation aisée, rapide, et peu coûteuse des gels d'agarose pas de dénaturation des échantillons l'agarose plus ferme et moins toxique que le gel de polyacrylamide les échantillons peuvent être récupérés en vue d'analyses supplémentaires Les avantages de l'électrophorèse en gel d'agarose sont:

42 42 DETAILS A VOIR EN TP

43 TD1.TECHNIQUES DE SEPARATION ET DANALYSE DES ACIDES NUCLÉIQUES 43 Le polyacrylamide est utilisé à des concentrations de 4% à 20% (poids/volume) et permet de séparer des molécules plus petites d'acides nucléiques. On peut aussi faire varier sa réticulation (taux de ramification) lors de la polymérisation pour moduler les paramètres de séparation ; 2.2.Electrophorèse sur gel de polyarylamide L'acrylamide est le nom usuel du 2-propénamide (amide acrylique) de formule brute C 3 H 5 NO. En biologie moléculaire, on utilise l'acrylamide polymérisé (polyacrylamide) pour réaliser des électrophorèses.

44 TD1.TECHNIQUES DE SEPARATION ET DANALYSE DES ACIDES NUCLÉIQUES 44 Efficace pour les petits fragments dADN entre 20 & 2000 paires de bases. (cartographie) GEL DACRYLAMIDE NATIF (LADN est double brin)

45 TD1.TECHNIQUES DE SEPARATION ET DANALYSE DES ACIDES NUCLÉIQUES 45 Efficace pour les très petits fragments dADN entre 1 & 400 paires de bases. (séquençage) GEL DACRYLAMIDE DENATURANT (LADN est double brin) + agent chaotropique: l'urée

46 TD1.TECHNIQUES DE SEPARATION ET DANALYSE DES ACIDES NUCLÉIQUES 46 La longueur de la molécule d'ADN : la séparation se fait en fonction du poids moléculaire et donc de la taille de l'ADN. La conformation de l'ADN: l'ADN plasmidique, non digéré par une enzyme de restriction, migre à différentes vitesses (du plus lent au plus rapide) : ADN circulaire, ADN linéaire et ADN superenroulé. La concentration du gel: l'augmentation de la concentration réduit la vitesse de migration et permet la séparation de fragment d'ADN de plus petite taille. Le voltage: plus le voltage est important, plus la vitesse de migration augmente. Toutefois le voltage est limité en intensité (5V/cm): un fort voltage augmentation de température (fondre le gel). Facteurs affectant la migration

47 TD1.TECHNIQUES DE SEPARATION ET DANALYSE DES ACIDES NUCLÉIQUES 47 Bande à moindre mobilité forme relâchée Bande à + forte mobilité forme superenroulée Electrophorèse de lADN plasmidique

48 TD1.TECHNIQUES DE SEPARATION ET DANALYSE DES ACIDES NUCLÉIQUES 48 Formes linéaire, relâchée, super-enroulée

49 TD1.TECHNIQUES DE SEPARATION ET DANALYSE DES ACIDES NUCLÉIQUES 49 La carte de restriction (= physique) est une représentation graphique de la localisation des sites reconnus par les principales enzymes de restriction sur une molécule dADN. 3.Elaboration de Cartes de restrictions des plasmides Définitions: A ne pas confondre avec « Carte génétique »: Représentation graphique de la position des gènes les uns par rapport aux autres sur un génome. Grâce à une telle carte, il est facile de prévoir la taille des fragments produits par digestion par une seule ou plusieurs enzymes de restriction.

50 TD1.TECHNIQUES DE SEPARATION ET DANALYSE DES ACIDES NUCLÉIQUES 50 Sites reconnus et types d'hydrolyse en décalé extrémités cohésives (3' sortant) en décalé extrémités cohésives (5' sortant) plein milieu du motif extrémités franches

51 TD1.TECHNIQUES DE SEPARATION ET DANALYSE DES ACIDES NUCLÉIQUES 51 Valeurs de longueurs en pb: produits de la digestion totale du plasmide pBR322 par Alu I. Utilisation comme marqueur de poids moléculaire

52 TD1.TECHNIQUES DE SEPARATION ET DANALYSE DES ACIDES NUCLÉIQUES 52 Carte du plasmide pBR322. Les sites existant à un seul exemplaire sur ce plasmide sont indiqués en gras.

53 TD1.TECHNIQUES DE SEPARATION ET DANALYSE DES ACIDES NUCLÉIQUES 53 Un polylinker = petite séquence d'ADN portant de très nombreux sites pour les enzymes de restriction les plus utilisées en génie génétique. Doté d'un polylinker, un plasmide ou un ADN de bactériophage devient un vecteur de clonage dans lequel il est possible d'insérer de l'ADN étranger. Notion de Polylinker

54 TD1.TECHNIQUES DE SEPARATION ET DANALYSE DES ACIDES NUCLÉIQUES 54 A DECOUVRIR EN TP


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