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1 I) Obtention de lADN recombinant ORGANISME DONNEUR : Extraction d'un fragment d'ADN d'intérêt VECTEUR (fragment d'ADN capable de réplication autonome)

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2 1 I) Obtention de lADN recombinant ORGANISME DONNEUR : Extraction d'un fragment d'ADN d'intérêt VECTEUR (fragment d'ADN capable de réplication autonome) Insertion du fragment d'intérêt dans le vecteur Obtention d'un ADN Recombinant 5 ) Amplification de lADN recombinant obtenu

3 2 5 ) Amplification de lADN recombinant obtenu : Transformation des bactéries 1) Mélange de plasmides et de bactéries compétentes sur glace (les bactéries compétentes ont été traitées pour faciliter l'entrée d'ADN : leur paroi a été fragilisée par un traitement au chlorure de calcium) (utilisation de Escherichia coli en général : utilisation facile, croissance rapide) 2) Choc thermique à 42°C : les plasmides vont pénétrer dans les bactéries 4) Étalement sur boîte (pour la sélection) 3) Ajout de milieu nutritif aux bactéries, croissance 1h à 37°C (cela permet l'expression des protéines de résistance aux antibiotiques pour la sélection ultérieure)

4 3 Mélange de bactéries transformées contenant le plasmide d'intérêt et de bactéries non transformées Étalement des bactéries sur une boîte contenant un milieu gélosé et un antibiotique : seules les bactéries transformées pourront se multiplier car le plasmide porte un gène de résistance contre l'antibiotique Colonie de bactéries transformées Il faut sélectionner les bactéries transformées (celles comportant le plasmide recombiné) 5 ) Amplification de lADN recombinant obtenu : Sélection des bactéries transformées

5 4 Ensemencement dune colonie de bactéries transformées dans du milieu liquide + antibiotique une nuit à 37°C => Multiplication des bactéries et donc amplification du nombre de plasmides recombinés (cf. présence d'une origine de réplication bactérienne sur le plasmide, l'antibiotique assure une pression de sélection pour que les bactéries conservent le plasmide) Il faut ensuite récupérer le plasmide 5 ) Amplification de lADN recombinant obtenu : Extraction du plasmide recombiné

6 5 Les bactéries sont lysées par un détergent en milieu alcalin afin de libérer l'ADN génomique et plasmidique. L'ADN génomique et les protéines sont précipités par de l'acétate de sodium. Le précipité est séparé par centrifugation, le surnageant contient l'ADN plasmidique. L'ADN plasmidique est alors précipité (volume double d'éthanol ou isopropanol), lavé puis redissous dans un tampon adéquat. Cette étape peut être réalisée avec des colonnes de purification dADN. 5 ) Amplification de lADN recombinant obtenu : Extraction du plasmide recombiné

7 6 I) Obtention de lADN recombinant ORGANISME DONNEUR : Extraction d'un fragment d'ADN d'intérêt VECTEUR (fragment d'ADN capable de réplication autonome) Insertion du fragment d'intérêt dans le vecteur Obtention d'un ADN Recombinant amplifié 6 ) Vérification de la construction Les bactéries poussant sur le milieu+antibiotique possèdent un plasmide avec le gène de résistance à lantibiotique. Mais ce plasmide contient-il linsert cloné ? Il peut y avoir religation du vecteur sur lui- même. Nécessité dun crible pour trouver les clones positifs ayant intégré lADN à cloner.

8 7 6 ) Vérification de la construction a) Vérification rapide par PCR Les bactéries transformées peuvent contenir le plasmide recombiné (contenant l'ADN qui nous intéresse) (1) ou le vecteur refermé sur lui- même (2) => il faut distinguer ces deux populations PCR avec les amorces ayant servi à l'obtention de l'insert, observation des produits formés sur gel d'agarose 1 2

9 8 Les bactéries transformées peuvent contenir le plasmide recombiné (contenant l'ADN qui nous intéresse) (1) ou le vecteur refermé sur lui- même (2) => il faut distinguer ces deux populations PCR avec les amorces ayant servi à l'obtention de l'insert, observation des produits formés sur gel d'agarose : Résultats du gel dagarose : (1)(2) Aucun produit détecté pour le vecteur seul (2), mais un produit visible pour le plasmide recombiné (1) 6 ) Vérification de la construction a) Vérification rapide par PCR

10 9 Digestion enzymatique par une enzyme avec un site présent dans l'insert et un seul site dans le vecteur : (ex : MscI) ) Vérification de la construction b) Vérification rapide par restriction

11 10 (1)(2) 1)Digestion enzymatique par une enzyme avec un site présent dans l'insert et un seul site dans le vecteur puis 2)Analyse des produits de restriction sur gel d'agarose On obtient des cartes de restriction différentes : une seule coupure et donc une seule bande pour le vecteur seul (2), deux coupures et donc deux bandes pour le plasmide recombiné (1) 6 ) Vérification de la construction b) Vérification rapide par restriction

12 11 ADN de séquence connue ADN de séquence inconnue, à séquencer 6 ) Vérification de la construction c) Vérification par séquençage : Principe de la méthode de Sanger Didésoxyribose : formation d'une liaison phosphoester impossible, blocage de l'élongation de la chaîne synthétisée P nucléotide Et de nucléotides didésoxyribose. 5-P-polynucléotide Choix d'une amorce Synthèse du brin complémentaire par une ADN polymérase La synthèse du brin complémentaire est faite en présence de nucléotides désoxyribose, Désoxyribose : formation possible d'une liaison phosphoester (élongation de la chaîne synthétisée) P nucléotide 5-P-polynucléotide

13 12 Réaction de synthèse du brin complémentaire de l'ADN à séquencer à partir d'une amorce, et en présence de nucléotides et d'un didésoxynucléotide => formation de fragments de différentes tailles, dont la synthèse est bloquée au niveau du didésoxynucléotide intégré : A-T-A-G-C-A-T-T-A-A-G-C-G-A amorce ADN à séquencer 5' 3' ddT T-A-ddT T-A-T-C-G-ddT T-A-T-C-G-T-A-A-ddT T-A-T-C-G-T-A-A-T-ddT T-A-T-C-G-T-A-A-T-T-C-G-C-ddT 5' Brins formés en présence de didésoxy- thymine (ddT) dans le milieu réactionnel 6 ) Vérification de la construction c) Vérification par séquençage : Principe de la méthode de Sanger

14 13 Les didésoxynucléotides sont marqués : radioactivité ou fluorescence. Analyse des différents brins formés sur gel ultra-résolutif (détection d'une différence d'un nucléotide) ddT 1 T-A-ddT 2 T-A-T-C-G-ddT 3 T-A-T-C-G-T-A-A-ddT 4 T-A-T-C-G-T-A-A-T-ddT 5 T-A-T-C-G-T-A-A-T-T-C-G-C-ddT 6 5' 6 ) Vérification de la construction c) Vérification par séquençage : Principe de la méthode de Sanger

15 14 T-A-T-C-G-T-A-A-T-T-C-G-C-T A-T-A-G-C-A-T-T-A-A-G-C-G-A ddTddAddGddC ADN à séquencer : Lecture du brin complémentaire : Une réaction de synthèse différente pour chacun des didésoxynucléotides, analyse sur gel pour chaque réaction, lecture du brin complémentaire (en partant des plus petits fragments vers les plus gros) ' 5' 6 ) Vérification de la construction c) Vérification par séquençage : Principe de la méthode de Sanger

16 15 ADN à séquencer : Lecture du brin complémentaire : 5'G-T-C-T-T-A-A-C-G-T-C-T-C-A 3'C-A-G-A-A-T-T-G-C-A-G-A-G-T Automatisation des résultats de séquençage : les didésoxynucléotides sont marqués avec des fluorescences différentes, cela permet de faire une seule réaction et une seule lecture. Le séquenceur détecte la fluorescence et repère la taille des fragments d'ADN. On obtient des courbes de fluorescences qui sont interprétées en terme de nucléotides avec un indice de confiance (ici barre verte : confiance maximum) 6 ) Vérification de la construction c) Vérification par séquençage : Automatisation du séquençage


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