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Chapitre 11: La technologie de l'ADN recombinant Objectifs : Connaître et être capable « d'appliquer » les techniques de l'ADN recombinant Contenu : Les.

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1 Chapitre 11: La technologie de l'ADN recombinant Objectifs : Connaître et être capable « d'appliquer » les techniques de l'ADN recombinant Contenu : Les enzymes de restriction Electrophorèse de l'ADN Réaction de polymérase en chaîne Séquençage des gènes Les cartes de restriction Clonage des gènes Utilisation des gènes comme sondes

2 Nombre de bases dans un gamète humain = 3 x 10 9 Nombre de bases dans une cellule somatique = 6 x 10 9 Distance entre deux bases = 3.4 x m 6 x 10 9 X 3.4 x m = 2m ! Nombre de cellules dans un humain = X 2m = 2 x m = 20 x 10 9 km Distance moyenne Terre-Soleil = 15 x 10 7 km

3 Réplication Chez les bactéries: ADN polymérase I, II et III impliquées dans la synthèse et la réparation Chez les eucaryotes: ADN polymérase,,, et … aussi impliquées dans la synthèse et la réparation ADN ligase = liaison covalente entre deux bases consécutives (fragments d'Okazaki)

4 Les activités des ADN polymérases 1) Polymérase 5 - 3' = Synthèse 5' - TAACA -> - 3' 3' - ATTGTCATC - 5' 2) Exonucléase 3 - 5' = Correction des erreurs de synthèse 5' - TAACC - 3' 3' - ATTGTCATC - 5' 5' - TAAC - 3' 3' - ATTGTCATC - 5' 5' - TAACA -> - 3' 3' - ATTGTCATC - 5'

5 3) Exonucléase 5' 3' = Dégradation des amorces d'ARN (et des bouts d'ADN) ARN 5' TAGCCGATAAUGGCA 3' ATCGGCTATTACCGTCAG 5' 5' TAGCCGATAATGGCAG-> 3' 3' ATCGGCTATTACCGTCAG 5'

6 Chez E. coli Activités 1 et 2 sur le "Gros fragment" de l'ADN polymérase = fragment KLENOW Activité 3 sur le "Petit fragment" de l'ADN polymérase 1 et 2 3

7 Que peut -on faire avec de lADN? Purifier lADN en le séparant du reste des constituants de la cellule: protéines, membranes, ARN etc… Visualiser lADN en utilisant le bromure dethidium… Couper lADN en fragments pour isoler un gène particulier… Amplifier par PCR un gène spécifique (réaction de polymérase en chaîne)… Déterminer la séquence en bases azotées dun fragment dADN On peut aussi faire du clonage de gènes!

8 Purification de lADN Lyse des cellules: tampon contenant un détergent et de la protéinase K (RNAse) Déprotéinisation par phénol:chloroforme Précipitation de lADN avec de lethanol et des sels et centrifugation Solubilisation du culot dADN dans de leau ou du tampon Tris: EDTA

9 Le bromure d'éthidium sintercale entre les bases de l'ADN. Le bromure d'éthidium absorbe la lumière ultraviolette et émet de la lumière visible: LADN devient ainsi visible sous les UV. Visualisation de lADN

10 Comment couper lADN en fragments? En utilisant les ultra-sons: par sonification, les morceaux sont obtenus par fragmentation aléatoire. En utilisant les enzymes de restriction, qui coupent à des sites bien spécifiques de lADN.

11 Fractionnement de l'ADN par électrophorèse Séparation de molécules chargées dans un champ électrique –L'ADN est chargé négativement parce quil contient des groupements phosphate (-) –On peut séparer les fragments dADN à l'aide d'un champ électrique si l'électrophorèse est faite dans un gel où les molécules devront "ramper" (comme un reptile) pour se déplacer (la reptation) –Les petits fragments vont plus vite que les gros

12 Enzymes de restriction Fonction: Constituent le mécanisme de défense "immunitaire" des bactéries contre leur phages –E. coli produit EcoRI (GAATTC) Les bactéries protègent leur propre ADN en méthylant certaines bases –E. coli GA m ATTC Les phages peuvent échapper aux enzymes de restriction des bactéries en: –Méthylant les mêmes bases –En n'ayant pas le site

13 Pour qu'un site de restriction soit protégé contre l'action des enzymes de restriction, il suffit qu'un seul des deux brins complémentaires de l'ADN soit méthylé –Hémi-méthylation Sinon les brins nouvellement répliqués pourraient être coupés avant d'être méthylés GA m ATTC C T TAAG

14 Palindromes : ELU PAR CETTE CRAPULE

15 Chromosome = 50 à 1000 millions de bases Gène = environ paires de bases (pb) Fréquence de coupure 1/4 6 = 1 / 4096 pb, 1/ 4 4 = 1 / 256 Dans un individu donné (avec cellules), toutes les copies d'un gène ont la même séquence. Donc, toutes les copies d'un gène particulier seront coupées aux mêmes endroits et seront sur un fragment d'ADN ayant une taille particulière E nucléotides E = Gène sur morceaux d'ADN ayant la même taille Utilité des enzymes de restriction

16 Cartes de restriction Enzyme #1 = Enzyme #2 = Enzymes #1 et #2 = 6, 1, 2, 8

17 Isolement dADN complémentaire chez les eucaryotes La transcription reverse permet dobtenir un fragment dADN dun gène à partir des molécules dARN messager (on obtient ADN complémentaire qui est sans introns). Cet ADN peut être cloné directement dans un vecteur dexpression.

18 Coupure des vecteurs de clonage

19 Construction de plasmides chimériques avec une enzyme de restriction

20 Clonage de l'ADN génomique

21 Réaction de polymérase en chaîne (PCR) Amplification d'un gène à l'aide d'amorces spécifiques (oligonucléotides)

22 cycle 0= 1 copie, cycle 1= 2 copies, cycle 2= 4 copies, cycle 3 = 8 copies, cycle 25 = 2 25 copies

23 La PCR nécessite : ADN (matrice par exemple lADN génomique) Deux amorces (2 oligonucléotides) Un mélange en excès des quatre nucléotides De l'ADN polymérase thermorésistante Taq Un tampon avec du MgCl 2

24 Programme thermique utilisé pour la PCR Dans une machine à PCR: 1 - Dénaturation à 94 o C, 1 minute 2 - Hybridation à de 37 o C à 65 o C, 1 minute 3 - Extension à 72 o C, 1 minute 4 - Revenir à létape 1 : 40 fois (41 cycles) 5 - Extension finale à 72 o C, 10 minutes 6 - Garder à 4 o C

25 L'ADN polymérase Taq Isolée à partir de la bactérie Thermus Aquaticus Cette bactérie vit à une température moyenne de 86 o C –Geysers du parc Yellow Stone Son ADN polymérase est stable à 95 o C pour 1 heure –Les enzymes "habituelles" sont inactivées après environ 5 min à 65 o C

26 La méthode enzymatique de séquençage, dite de (Sanger; didésoxy) Méthode de synthèse partielle basée sur l'arrêt de la synthèse par l'incorporation de didésoxynucléotides Nécessite: Brin simple matrice Amorce ADN polymérase (Klenow) Déoxynucléotides Didéoxynucléotides

27

28 d

29

30 Le séquençage automatique


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