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Atténuer le virus naturel de la VHD par mutagénèse dirigée et à terme l'extrapoler à l'EBHS.

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Présentation au sujet: "Atténuer le virus naturel de la VHD par mutagénèse dirigée et à terme l'extrapoler à l'EBHS."— Transcription de la présentation:

1 Atténuer le virus naturel de la VHD par mutagénèse dirigée et à terme l'extrapoler à l'EBHS

2 Virus de la VHD 40 nm ARN simple brin 7437 bases

3 Virus pathogène de la VHD Structure déterminée aux rayons X. La capside que lon voit est uniquement constituée dune même protéine repétée plusieurs fois (VP60, 579 aminoacides). Le code est à lintérieur sous la forme du brin dARN de 7437 b.

4 VHD souche Pascal Harlaud 1/ Foie de lapin mort de la VHD envoyé par Pascal Harlaud.

5 2/ Extraction de lARN viral broyage, centrifugation, purification

6 3/ Transcription en ADN Le code VHD est un ARN simple brin. (7437b) Il est fragile. Nous lavons traduit en ADN double brin, plus stable pour létudier et le modifier. ReverseTranscriptase-PCR

7 4/ Lecture du code ADN a) description du code (4 lettres A, T, C, G) Code ADN à Double brin

8 b) Lecture du code Rouge = T Noir = G Vert = A Bleu = C

9 Code des 7437 pb de lADN complémentaire du virus VHD Pascal H.

10

11 cDNA (ADN complémentaire) du virus Pascal Harlaud F1 = 2650 bp F2 = 2737 bp F3 = 2050 BstBIBamH I AvrII On na pas pu insérer le génome entier dans un plasmide, on a donc décidé de le couper en 3 morceaux F1 = 2650 bp F2 = 2737 bp F3 = 2050

12 Coupure par des ciseaux spécifiques (enzymes) …G G A T C C …………………..C C T A G G ………… …C C T A G G …………………..G G A T C C ………… Exemple ADN viral Ou plasmide …G G A T C C …………………..C C T A G G ………… …C C T A G G …………………..G G A T C C ………… …G C T A G G ………… …C C T A G C ………… Ciseaux Plasmide Ouvert avec Un brin en Moins.

13 Colle …G C T A G G ………… …C C T A G C ………… Plasmide Ouvert avec Un brin en Moins. G A T C C …………………………………………..C G……………………………………………G G A T C Fragment du génome Du virus de La VHD Association spontanée …G G A T C C …………………………………………C C T A G G …… …C C T A G G………………………………………….G G A T C C …… Création de la Liaison : (ADN ligase + ATP) …G G A T C C …………………………………………C C T A G G …… …C C T A G G………………………………………….G G A T C C …… Liaison à créer

14 Litmus 28i Multi site de clonage promoteurT7 RNA Viral RHDV RT-PCR F3F1 BamHI AvrII BstBI 4/ Digestion BstBI-BamHI 1/ Digestion du plasmide 1 par BamHI-AvrII pF3 pF1+F3 Construction d'un clone Infectieux de RHDV Plasmide 1 2/ ajout de F3 préparé par RT-PCR 3/ Ligation de plasmide 1 et F3 par ADN ligase. 5/ ajout de F1 préparé par RT-PCR 6/ Ligation de pF3 et F1 par ADN ligase. Nous avons déjà les 2/3 du génome complet quelques mois de travaux supplémentaires semblent nécessaires pour pouvoir insérer Le troisième fragment F2 et avoir le génome complet de la VHD dans un plasmide. F2

15 Extraction du RNA viral ReverseTranscriptase-PCR cDNA (ADN complémentaire) F1 = 2650 bp F2 = 2737 bp F3 = 2050 Clonage dans un plasmide Séquençage pour confirmation des séquences Mutagénèse dirigée Transcription in vitro (ADN-ARN) Transfection (cellules permissives, lapin) BstBIBamH I AvrII Purification du virus VHD Génome viral complet RNA 7437 b


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