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TP master 1 Transfection. La transfection des cellules eucaryotes Définition et Principe Transfert de gènes (ADNc) codant pour une protéine dans une cellule.

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1 TP master 1 Transfection

2 La transfection des cellules eucaryotes Définition et Principe Transfert de gènes (ADNc) codant pour une protéine dans une cellule = protéine exogène Transfection Infection (méthode virale) Surexpression de cette protéine grâce à la machinerie cellulaire (transcription/traduction) ribosomes ARN protéine exogène ADN (2) Etude in situ (1) Etude à partir de lysat protéique (activité enzymatique) Une cellule eucaryote

3 Techniques Réactifs chimiques - Calcium phosphate - DEAE-dextran - Liposomes artificiels Méthodes physiques - Microinjection directe (dans la cellule ou le noyau) : animaux transgéniques - Electroporation (perturbation de la membrane par un choc électrique) - Propulsion de microprojectiles contenant de lADN (in vivo) : plantes Utilisation de particules virales - Rétrovirus - Adénovirus - Particules virales non infectieuses

4 Réactifs chimiques DEAE-dextran 1965 par Vaheri et Pagano Technique classique, in vitro DEAE-dextran = polymère cationique Association avec les acides nucléiques chargés négativement Endocytosecytoplasmenoyau

5 Réactifs chimiques Calcium phosphate 1973 par Graham et van der Eb Technique classique et bon marché, in vitro Mise en contact de lADN avec du chlorure de calcium dans un tampon phosphate Formation dun précipité entre le calcium et lADN Précipité dans la cellule par endocytose ou phagocytose

6 Réactifs chimiques Liposomes artificiels 1980 par Fraley et co. Efficacité de transfection, fragments dADN, types cellulaires, in vitro et in vivo Liposomes = lipides cationiques (+ lipides neutres) Réaction avec les acides nucléiques chargés négativement Compaction de lADN = complexe liposomes-ADN Endocytosecytoplasmenoyau

7 Applications (in vitro) 1. Surexpression de protéines absentes dans un type cellulaire donné : 2. Modifier un gène existant / inhiber lexpression dun gène existant Promoteur du vecteurADNc codant pour la protéine sa fonction - sa localisation in situ - son interaction avec dautres protéines de la cellule ou une autre protéine transfectée (co-transfection avec 2 plasmides) Etude de lactivité dun promoteur et sa régulation in situ Elaborer une lignée cellulaire immortelle protéine exogène = Antigène T du virus SV40 - … Promoteur à étudierGène rapporteurPromoteur du vecteurADNc codant pour lAg T

8 Surexpression de protéines : Mise en évidence Transfection dun ADNc codant pour une protéine non modifiée - Détection par immunocytochimie ou par Western blot Transfection dune construction possédant lADNc dintérêt et une étiquette (« tag ») = Protéine de fusion - GFP (Green Fluorescent Protein) - HA, flag, c-myc … (anticorps) ADNctag protéine de fusion ribosomes ARN protéine exogène ADN Etude in situ

9 Etude de lactivité dun promoteur : Mise en évidence promoteurgène rapporteur galactosidase Effet de facteurs endogènes (facteurs de transcription) Effet de facteurs exogènes sur lactivité du promoteur - facteurs de croissance ajoutés dans le milieu de culture - transfection avec une 2 ème construction codant pour une protéine pouvant réguler le promoteur étudié = co-transfection -galactosidase (spectrophotomètre) Luciférase (luminescence) ribosomes ARN protéine exogène ADN in situ galactosidase lysat protéique activité enzymatique galactosidase Mesure quantitative

10 Préparation de lADN à transfecter Réalisation de constructions plasmidiques : vecteur + ADNc/promoteur-gène rapporteur ETUDEcatégorie de vecteurs à utiliser Vecteur commum dexpression Plasmide GFPtagPlasmide activité promotrice

11 Vecteur commum dexpression Promega

12 Plasmide GFPtag ou étiquette GFP Promega

13 Plasmide permettant détudier lactivité dun site spécifique dun promoteur Clontech

14 Transfection transitoire - Analyse de la transfection à h -Perte du plasmide en quelques jours Transfection stable -Transfection à long terme - LADN est généralement intégré au niveau chromosomique - Isolation des clones cellulaires par dilutions limites (clonage cellulaire) -Criblage par résistance à un antibiotique des clones possédant lADN transfecté (néomycine, hygromycine, …) semaines Deux approches

15 Travaux pratiques de Master BCPP BUT : Transfecter des cellules COS avec des constructions plasmidiques contenant différents ADNc Technique des liposomes Plasmide 1Plasmide 2Plasmide 3 Protéine X-GFPProtéine Z-HA galactosidase Fluorescence directeImmunocytofluorescence Réaction enzymatique colorimétrique

16 Plasmide 1 Protéine X-GFP Fluorescence directe (vert) ADN * X-GFP

17 ADN Z-HA Plasmide 2 Protéine Z-HA Immunocytofluorescence (1)Anticorps de souris anti-protéine HA (anticorps primaire) (1) (2) * (2) Anticorps de chèvre anti-IgG de souris conjugué à la rhodamine (TRITC) (anticorps secondaire) *

18 Plasmide 3 Galactosidase Réaction enzymatique colorimétrique (cellules bleues) Avantages (1)Mise en évidence facile et rapide (2)Mesure quantitative (in situ) : nombre de cellules bleues / population totale (3) Mesure qualitative (dosage colorimétrique : Luciférase) Rôle de ce type de construction (1) Vérifier que le type cellulaire utilisé peut être transfecté (2) Mesurer une efficacité de transfection Substrat de lenzyme = X-gal

19 Plasmide Protéine Z - HA + Protéine X - GFP Localisation de 2 protéines au niveau dune même cellule Besoin de 2 fluorochomes

20 Noyaux (PI: iodure de propidium, DAPI, YOYO, …) Filaments dactine, cytosquelette (rhodamine-phalloïdine) Marqueurs spécifiques du réticulum endoplasmique Marqueurs membranaires Mise en évidence de la présence dune cellule Marqueurs généraux = La cellule en entière ou des structures particulières


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