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Biochimie appliquée Université Dr. Moulay Tahar de SAIDA II- Biochimie des substances dorigine animale (2)

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1 Biochimie appliquée Université Dr. Moulay Tahar de SAIDA II- Biochimie des substances dorigine animale (2)

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3 Culture de cellules animales : anticorps monoclonaux Introduction Anticorps Antigène Protéine

4 Culture de cellules animales : anticorps monoclonaux Introduction Utilisation en diagnostic dans pratiquement tout le domaine du monde vivant : agroalimentaire, vétérinaire, microbiologique. Une action ciblée sur un antigène spécifique dune cellule responsable du processus pathogène assurant sa destruction.

5 Historique Culture de cellules animales : anticorps monoclonaux Présent Georges Köhler et César Milstein: la technique dobtention des anticorps monoclonaux premier Ac monoclonal mis sur le marché: Muromomab (anti-CD3) Ac monoclonaux humanisés production dAc monoclonaux humains par des souris transgéniques ou transchromosomiques Plusieurs progressions Ac monoclonaux chimériques souris/homme

6 Définition Culture de cellules animales : anticorps monoclonaux Ils sont très largement utilisés en biologie et en médecine, à la fois comme outils de diagnostic et dans des buts thérapeutiques. Ils sont homogènes contrairement aux anticorps polyclonaux. Ils reconnaissent un type unique de site antigénique, Les anticorps monoclonaux ou monoclonal antibody sont identiques car produits par un clone de cellules spécialisées du système immunitaire (les plamocytes).

7 Culture de cellules animales : anticorps monoclonaux Rappel Lorsque les immunoglobulines lient une molécule ou une particule virale ou bactérienne, les immunoglobulines sont toutes désignées sous le nom danticorps, et lentité reconnue est appelée antigène. Deux propriétés : - capacité de lier spécifiquement un ou plusieurs ligands, et - participation à une ou plusieurs fonctions effectrices (activation du complément, stimulation de la phagocytose, sécrétion damines …) Deux propriétés : - capacité de lier spécifiquement un ou plusieurs ligands, et - participation à une ou plusieurs fonctions effectrices (activation du complément, stimulation de la phagocytose, sécrétion damines …) Anticorps Caractérisation LAc joue un rôle essentiel dans la réponse immunitaire : - cest le récepteur, à la surface des lymphocytes B ou en solution dans le sérum, - cest le transmetteur ou lactivateur de signaux physiologiques. LAc joue un rôle essentiel dans la réponse immunitaire : - cest le récepteur, à la surface des lymphocytes B ou en solution dans le sérum, - cest le transmetteur ou lactivateur de signaux physiologiques. Rôles

8 Culture de cellules animales : anticorps monoclonaux Rappel Structure

9 Production Culture de cellules animales : anticorps monoclonaux Deux principales techniques sont utilisées dans la plupart des laboratoires producteurs des anticorps monoclonaux la technique de transformation lymphoblastoide par le virus dEpstein Barr EBV La technique des hybridomes

10 Production Culture de cellules animales : anticorps monoclonaux La technique des hybridomes fusion des cellules sélection des hybridomes isolement des hybridomes test des hybridomes production des hybridomes Déroulement de la production des hybridomes obtention des cellules

11 Production Culture de cellules animales : anticorps monoclonaux La technique des hybridomes Obtention des cellules Immunisation de la souris avec lantigène étudié Immunisation de la souris avec lantigène étudié Obtention des lymphocytes spécifiques Obtention des lymphocytes spécifiques Obtention des lymphocytes spécifiques Obtention des lymphocytes spécifiques Utilisation de cellules myélomateuses HGPRT Utilisation de cellules myélomateuses HGPRT Obtention des cellules immortelles Fusion

12 Production Culture de cellules animales : anticorps monoclonaux La technique des hybridomes Fusion des cellules Par méthode chimique Par méthode physique fusion des membranes cellulaires avec poly éthylène glycol fusion des membranes cellulaires avec poly éthylène glycol fusion des membranes cellulaires par électroporation fusion des membranes cellulaires par électroporation sélection

13 Production Culture de cellules animales : anticorps monoclonaux La technique des hybridomes Sélection des hybridomes Culture sur milieu HAT (Hypoxanthine Aminoptérine Thymidine) MORT CELLULAIRE Impossibilité de se diviser Cellule myélomateuse HGPRT- HYBRIDOME SELECTIONNE Lymphocyte B MORT CELLULAIRE disparition après quelques divisions

14 Production Culture de cellules animales : anticorps monoclonaux La technique des hybridomes Isolement des hybridomes Dès que la croissance est suffisante, il faut propager les cultures d'hybridomes productrices de l'anticorps désiré (transferts des puits de 0,3 à 2 ml, puis à des bouteilles de 25 ml), les conserver et les cloner. Deux méthodes sont utilisées pour obtenir un clone à partir d'une cellule :

15 Production Culture de cellules animales : anticorps monoclonaux La technique des hybridomes Isolement des hybridomes Sur milieu gélosé Par dilution limite Une colonie = une cellule initialeUne ou zéro cellules par puit

16 Production Culture de cellules animales : anticorps monoclonaux La technique des hybridomes Test des hybridomes Test sur le surnageant de chaque puits de la présence des anticorps monoclonaux par la méthode ELISA du type danticorps produit par des méthodes dimmunoprécipitation

17 Production Culture de cellules animales : anticorps monoclonaux La technique des hybridomes Production des ACM Amplification des hybridomes obtention des anticorps monoclonaux Conservation des hybridomes Production par cultures cellulaires Production par cultures cellulaires Production dans les liquides d'ascites Production dans les liquides d'ascites

18 Production Culture de cellules animales : anticorps monoclonaux La technique des hybridomes Hypoxanthine IMP AMP GMP Synthèse endogène TMPThymidine HGPRT Thymidine Kinase Azasérine Aminoptérine Milieu HAT : Hypoxanthine, aminoptérine, thymidine Milieu Haza : Hypoxanthine, azasérine

19 Production Culture de cellules animales : anticorps monoclonaux la technique de transformation lymphoblastoide par le virus dEpstein Barr EBV Il sagit de transformer et de rendre cancéreux un lymphocyte humain sécréteur dun anticorps donné en y introduisant le virus dEpstein-Barr EBV. LEBV possède la propriété remarquable dinduire la prolifération continue des lymphocytes B infectés.

20 Production Culture de cellules animales : anticorps monoclonaux la technique de transformation lymphoblastoide par le virus dEpstein Barr EBV Le virus est un membre de la famille des herpès virus. Il infecte 90 % à 95 % des adultes. Il est responsable de la mononucléose infectieuse et du lymphome de Burkitt.

21 Production Culture de cellules animales : anticorps monoclonaux la technique de transformation lymphoblastoide par le virus dEpstein Barr EBV Les lymphocytes sécréteurs dun anticorps obtenus chez un sujet immunisé suite à une infection ou à une transfusion, sont séparés des autres éléments figurés du sang sur gradient de densité Ils sont ensuite incubés en présence du virus selon différents protocoles.

22 Applications Culture de cellules animales : anticorps monoclonaux Ils sont utilisés pour la détermination des groupes sanguins ABO et Rhésus, pour les groupages tissulaires HLA et pour limmunomarquage des leucémies aigues. la compréhension de nombreux processus biologiques. Pour distinguer plusieurs sous-populations lymphocytaires. la protéomique et les tests de dépistage biologiques en masse. Dune façon générale, les anticorps monoclonaux sont utilisés en diagnostic dans pratiquement tout le domaine du monde vivant : agroalimentaire, vétérinaire, microbiologique. Une action ciblée sur un antigène spécifique dune cellule responsable du processus pathogène assurant sa destruction.


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