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- Lanalyse des résultats de double hybride (fig 1B) montre que les protéines SRC1-N et GRIP1-N sont capables dinteragir avec LMP2 dans un système cellulaire.

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1 - Lanalyse des résultats de double hybride (fig 1B) montre que les protéines SRC1-N et GRIP1-N sont capables dinteragir avec LMP2 dans un système cellulaire comme la levure, en témoigne lactivation du gène rapporteur obtenu dans les cellules cotransfectées par les vecteurs pACT2-LMP2 et pGBKT7-SRC1N ou pACT2-LMP2 et pGBKT7-GRIP1N. - Lautoradiograhie présentée fig1C indique que les protéines SRC-1, GRIP1, A/B1, SRC-1-N,GRIP1-N, AIB1N interagissent physiquement avec la protéine GST-LIMP2 alors que ces mêmes protéines ninteragissent pas avec la protéine GST. De plus, les protéines SRC1-C, GRIP1-C et A/B1-C ne sont liées ni par la protéine GST, ni par la protéine GST-LIMP2. Cette expérience indique que les protéines SRC-1, GRIP1, AIB1 interagissent avec LMP2 via leur domaine N-terminale. - Lexpérience de co-immunoprécipitation réalisée dans les cellules ECC1 montre que la protéine LMP2 est spécifiquement précipitée par lanticoprs LMP2 (elle nest pas présente dans les extraits immunoprécipités par lanticorps control). Par ailleurs, cette immunoprecipitation avec lanticorps LMP2 entraîne les protéines SRC-1 et GRIP1. -La dernière expérience de GST pull-down montre que la protéine SRC-1 interagit physiquement avec le récepteur aux estrogènes alors que la protéine LMP2 nen est pas capable. Note sur 4 -compréhension : 2 -clarté : 2

2 - La première expérience réalisée par WB montre que lexpression des protéines SRC1, GRIP1 et AIB1 nest pas modifiée par lexpression de la protéine LMP2. Seule la quantité de protéine LMP2 augmente dans les cellules transfectées par le vecteur permettant lexpression de LMP2, comparé à la quantité de protéines observées dans les cellules contrôles (transfectées par le vecteur vide). Il ny a pas daction de LMP2 sur lexpression des coactivateurs. -Les figures B et C montrent que lE2 augmente lexpression des vecteurs CyclinD1luc, EREluc transfectés dans des cellules ECC-1. Par ailleurs, une analyse par RT-PCRQ montre que la quantité dARNm Cyclin D1 et pS2 endogène est également augmentée après stimulation par E2 dans ces cellules. Cette augmentation de la transcription des plasmides ou de la quantité des ARNm endogènes est accrue de manière significative lorsque les cellules expriment la protéine LMP2. Cette augmentation est abolit en présence de RNAi LMP2. LMP2 augmente la transcription des gènes estrogéno-dépendants. -La figure D montre que la quantité de luciferase (produit du gène rapporteur) est plus importante dans les cellules co-transfectées par le vecteur dexpression LMP2 et les vecteurs exprimant les coactivateurs SRC-1, GRIP1 et AIB1, démontrant une coopération de ces protéines dans lactivation de la transcription du gène rapporteur. Lexpérience de RNAi montre que lorsque les 3 membres de la familles p160 sont ciblés, lexpression du plasmide est inhibée. -La figure E rend compte de la quantité de chaque protéine SRC1, GRIP1, AIB1 et LMP2 dans les différentes conditions expérimentales. Note sur 4 -compréhension : 2 -clarté : 2

3 - La figure A permet de positionner sur le gène pS2 les régions amplifiées avec les différentes amorces utilisées dans les expériences de ChIP. La taille des fragments dADN est présentée dans la figure C. -Lexpérience de ChIP présentée figure B montre que en présence dE2, la région du promoteur située entre -353 et -30 est immunoprécipitée par tous les AC utilisés, démontrant une proximité de ces facteurs sur le promoteur du gène pS2 et une association de ces protéines dans un même complexe. De plus, dautres régions du gène sont immuno- précipités avec lAC anti LMP2, démontrant que la protéine se localise à différentes position du gène. -La figure D montre que la région est précipitée avec les AC anti RE, SRC1, LMP2, polII mais pas avec lAC anti elongin A. La figure D présente également les résultats dune expérience de double IP. Les fragments dADN sont immunoprécipités à laide dun premier AC, puis dun deuxième AC. Après une 1 er immunoprecipitation avec un AC anti RE, la région est immunoprécipitée avec les AC anti SRC1,LMP2 et polII. De même, après une immunoprecipitation avec un AC anti SRC1, la région est immu- noprécipitée avec les AC anti RE, LMP2 et polII. polII a RE SRC1 AIB1 GRIP1 LMP2 Note sur 3 -compréhension : 1,5 -clarté : 1,5 Rôle de LMP2 dans linitiation de la transcription. Rôle de LMP2 dans la phase délongation?

4 Note sur 3 -compréhension : 1,5 -clarté : 1,5 Cette figure rend compte dexpériences de double ChIP réalisés à laide de différents anticorps. Lanalyse de ces double ChIP montre que les protéines LMP2, polII et Elongin sont associées dans un même complexe. Ces résultats suggèrent que LMP2 joue également un rôle pendant lélongation de la transcription.

5 Note sur 3 -compréhension : 1,5 -clarté : 1,5 A. Cette figure montre le caractère cyclique du recrutement des protéines sur le promoteur. Ce recrutement cyclique des protéines ne se fait plus lorsquon empêche lexpression de LMP2 ou des protéines p160. Lorsquon bloque lexpression de LMP2, ces cycles de recrutement sont à nouveau possible si on exprime un peu plus tard la protéine LMP2. B. Ces western blot témoignent de la quantité des protéines étudiées en ChIP. C. Cette expérience montre laugmentation de la transcription dun vecteur rapporteur estrogénodépendant en présence de protéine LMP2. Le recrutement des co-activateurs sur le promoteur et lactivation de la transcription nécessite la protéine LMP2.

6 Note sur 3 -compréhension : 1,5 -clarté : 1,5 A. Lactivation de la transcription médiée par E2 + LMP2 est abolit en présence dinhibiteur du protéasome MG132.


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