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Sonic hedgehog (SHH) guide les axones commissuraux le long de laxe longitudinal du cordon spinal. Dimitris Bourikas et toute son équipe.

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1 Sonic hedgehog (SHH) guide les axones commissuraux le long de laxe longitudinal du cordon spinal. Dimitris Bourikas et toute son équipe.

2 INTRODUCTION Durant le développement des circuits neuronaux les axones en croissance se dirigent vers des cellules cibles,en réponse a des signaux de guidage répulsifs et/ou attractifs. Un des modèles de guidage axonal très étudié est celui des axones commissuraux situés dans le tube neural.

3 Rappel sur le développement du système nerveux

4 A la partie la plus antérieur (rostrale) du Tube Neural, on a les vésicules céphaliques qui se forment. A la partie la plus postérieur (caudale) du Tube Neural, on a une segmentation des somites.

5 Dans TN, on a des progéniteurs pour différentes structures cellulaires. Certains vont donner des neurones commissuraux. Leur axones entrent en contact étroit avec la surface de la pp, traversent la ligne médiane et tournent rostralement le long de laxe longitudinal du cordon spinal.

6 Mise en évidence du guidage axonal par la technique de « Open–Book » :

7 BUT : Mettre en évidence des molécules intervenant dans le guidage des axones commissuraux

8 Model: Embryon de poulet Partie lombo-sacrale Stade du développement: Stade 23 Stade 25/26 Stade 24

9 Découverte de Shh par hybridation soustractive :

10 Hybridation soustractive : Stade 20 Stade 26 ARNm de PP A B C D ABCD E F G Comparaison E F G ADNc Séquençage et lignage Bio Info SHH

11 Rôle de SHH dans le guidage axonal des neurones commissuraux (1): Perte de fonction de shh par RNAi in ovo: Pas de modification sur la croissance des axones. +RNAi Wt

12 Rôle de SHH dans le guidage axonal des neurones commissuraux : Absence dorientation rostrale. Les axones restent au niveau des bordure de la PP et dans la plupart des cas ils tournent caudalement… …mais sembleraient rétablir leur trajectoire en formant des boucles (fig d)

13 La perte de fonction de SHH montre un blocage dans lorientation rostrale des axones commissuraux. Ceci a été confirmé par lutilisation dAC bloquant la fonction de SHH. SHH est donc nécessaire pour le lorientation rostrale des axones commissuraux…des expériences complémentaires ont révélés une action directe de SHH.

14 Les récepteurs de Shh : Pour savoir si Ptc et Smo sont associés aux effets de Shh sur les axones commissuraux, on analyse leur patron expression au stade Stade 23 Patched (Ptc) et Smoothened (Smo) = co-recepteur de Shh médiant ses activités inductibles. Stade 24

15 Patron expression de Ax1,Smo,Ptc Axonin-1(Ax1)=molécule dadhésion exprimée par les axones commissuraux (AC). Pas dexpression de Smo et Ptc par AC. Ceci suggère quils ne sont pas requis pour laction de SHH. Hybridation in situ Autre expérience: utilisation de cyclopamine, inhibiteur de Smo ne modifie pas lorientation rostrale

16 Proteine transmembranaire liant directement les proteines Hedgehog (Indian, Desert, Sonic) Patron expression de Hip au stade 23,24,26 Les récepteurs de Shh :Hip

17 Hybridation in situ Stade 23: pas dexpression de Hip. Stade 24 : expression de Hip. Stade 26 : peu dexpression de Hip. Conclusion : Hip est exprimé par quelques neurones pendant un temps bref Expression temporellement et transitoire

18 Perte de fonction de Hip: RNAi Lors dune perturbation des fonctions Hip: Phénotype identique à celui observé lors du RNAi de SHH. Hip est le récepteur médiant leffet de Shh.

19 Hip et SHH permettent dorienter les AC au niveau rostral du cordon spinal. Questions : Pourquoi au niveau rostral et non caudal ? Quelle est la différence entre ces deux niveaux ?

20 Gradient de SHH le long de laxe longitudinal du cordon spinal : Hybridation in situ de shh au stade 25 Forte expression de SHH au niveau Caudal. Faible expression au niveau rostral. Gradient dexpression de SHH tout le long le laxe longitudinal du cordon spinal. Ce gradient suggère un mécanisme de répulsion de SHH sur les AC

21 Expérience de gain de fonction de SHH : Electroporation in ovo permettant dexprimer Shh sélectivement : ThoraciqueNiveau supérieur lumbo-sacralNiveau caudal lumbo-sacral

22 Les AC ne quittent pas la PP en présence de concentration élevé de SHH. Les AC se dirigent en évitant les concentration de SHH élevé soit caudalement soit rostralement.

23 Ce modèle détude permet de confirmer leffet répulsif de SHH quand les neurones doivent tourner rostralement cest-à-dire au moment oú ils expriment Hip à leur surface.

24 Confirmation de leffet répulsif de SHH par un modèle in vitro : Explant dembryon de stade Culture dans gel collagène Bille-SHHBille-BSA Marquage des NC avec une molécule fluorescente

25 Résultat : Pas de prologement daxone en direction de la bille-SHH Présence de prolongement daxone en direction de la bille-BSA. Effet répulsif de shh sur les AC du cordon spinal.

26 Conclusion et Discussion : Au début de la formation du TN, Shh a un effet attractant et permet la croissance des AC vers la PP du cordon spinal. Ces effets sont permis par les co-récepteurs Smo et Ptc exprimés par les AC. Puis Shh dirige les AC le long de laxe longitudinal du cordon spinal en direction rostral oú on trouve des régions pauvres en Shh. Cet effet répulsif est permis par lexpression de Hip par les AC. Grâce au technique de RNAi in ovo, on a identifié le rôle de shh dans le guidage axonal.

27 Quelques mécanismes incompris : Hip protéine membranaire de type I : –Pas de domaine intracellulaire. –La partie C(ter) est hydrophobe donc transmembranaire. Prb : Comment Hip transmet le signal pour la migration des AC au niveau rostral ? Réponse : Hip pourrait être un composant dun récepteur complexe composé dune unité liant SHH (Hip) et dune unité transmettant le signal qui n pas été encore identifié.

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