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Fibroblaste Growth factors induce Additional limb developpement from the Flank of Chick Embryos. Martin J. Cohn, juan Carlos Izpisùa-Belmonte, helen Abud,

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1 Fibroblaste Growth factors induce Additional limb developpement from the Flank of Chick Embryos. Martin J. Cohn, juan Carlos Izpisùa-Belmonte, helen Abud, John K. Heath, and Cheryll Tickle.

2 Introduction Chez la plupart des vertébrés, deux paires de bourgeons de membre se forment à partir de la plaque latérale du mésoderme, à un niveau axial particulier et se développent pour donner les membres. Se sont des interactions cellulaires à lintérieur même du bourgeon qui conduisent à la morphogenèse des membres. La crête apicale ectodermique (AER) maintient la croissance proximodistale en gardant les cellules de lextrémité du bourgeon, dans un état de prolifération continue, mais en stade indifférencié.

3 Le signal AER peut être substitué par lapplication dun facteur de croissance de fibroblaste (FGF). Dans la marge postérieure du bourgeon, il existe une région polarisée. Le développement du membre est dû à limplication de cette région avec les FGF. Shh, responsable de cette activité polarisante est capable dinduire la duplication de doigts (le long de laxe antéropostérieur du membre). Il est aussi lactivateur de certains gènes Hox nécessaires à la formation des membres.

4 Des billes FGF1, FGF 2 et FGF 4 injectées dans le flanc dun embryon de poulet donnent un ou plusieurs membre(s) supplémentaire(s). (Figure 1) -Stade 13: Bien avant que les 1er signes de bourgeon apparaissent. -Stade 17: Épaississement de la plaque latérale du mésoderme où se formera le bourgeon. Le flanc apparaît entre les somites 21 et 25. Linjection de FGF induit le développement de membre(s) supplémentaire(s):

5 On injecte des billes FGF 2 à différents niveaux du corps dans le mésoderme entre les stades 13 et 17. -Injection entre les somites 20-26: Membres supplémentaires, ailes et pattes complètes apparaissent sur le flanc. Expérience :

6 Si on injecte les billes proche du cou ou de la queue, on na pas formation de membre supplémentaire. Le potentiel pour avoir un membre supplémentaire se développant sur le flanc semble être maximale à partir du stade 13. Les embryons traités des stades 10 à 12, ne présentent pas de membres supplémentaires, mais les ailes et pattes peuvent se déplacer le long du corps et quelques fois il y a des malformations. La capacité à produire un membre supplémentaire dure jusquau stade 17.

7 Tableau 1:

8 Ils sont en général complets. Quelques fois développement retardé. Quelques fois laile normale est tronquée. Quelques fois laile supplémentaire manque de structure(s) distale(s). Patron dexpression du membre supplémentaire:

9 Figure 4:

10 -Quand les billes sont injectées dans la partie antérieure du flanc (somites 21-22): Les membres supplémentaires sont des ailes. -Quand les billes sont injectées au milieu du flanc (somites 23): Les membres supplémentaires sont des ailes, des pattes ou des chimères. -Quand les billes sont injectées dans la partie postérieure du flanc (somite 24): Les membres supplémentaires sont des ailes et des pattes. -Quand les billes sont injectées encore plus postérieurement (somite 25): Seules des pattes peuvent se former. La nature des membres supplémentaires est relative à la position dinjection des billes.

11 Si les billes sont injectées à lendroit où les ailes et les pattes normales se forment: Nous obtenons un membre chimérique prés du membre normal, présentant les éléments proximaux de la patte, et les doigts des ailes.

12 Nous constatons ensuite quun seul des membres supplémentaires avec doigts, a une polarité antéropostérieure normale. Dans tous les autres cas, laxe antéropostérieur est inversé. La plupart des membres développant des doigts dailes après implantation de billes FGF2 du côté antérieur ou au milieu de flanc (somites 20-23) possèdent un doigt n°3 supplémentaire.

13 Les membres à polarité inversée résultant de linjection de billes FGF2 dans le flanc postérieur nont jamais de doigts supplémentaires. Un membre supplémentaire peut fusionner avec laile normale. On obtient un membre inversé, où les doigts postérieurs se retrouvent au milieu.

14 Quelques fois los de lavant bras est fusionné à lintersection des deux membres en un seul large élément, et les doigts postérieurs ne se forment pas.

15 En plus de causer lapparition de membre supplémentaire, FGF peut déplacer laile postérieurement, le long de laxe du corps. Mais il peut aussi induire le développement dune seule grande excroissance le long du tronc, qui contient les éléments squelettiques de laile et de la patte. Mais ceci ne peut pas sassimiler à une fusion.

16 Développement précoce du membre supplémentaire. Figure 3: Insertion de billes FGF2 dans le flanc de lembryon et observation du développement des membres: On observe la formation dun bourgeon de membre supplémentaire entre le bourgeon de laile et celui de la patte. Mais celui-ci est légèrement atrophié par rapport au bourgeons de membres normaux. On note que le bourgeon supplémentaire présente une région AER bien développée.

17 Tableau 2: Implantation de billes FGF2, puis extraction de celles-ci à différents temps. Et observation de leffet sur le développement des membres. Résultat: Lextraction des billes après 2 heures, ninterfère pas avec la croissance et le développement des membres supplémentaires.

18 Les bourgeons de membres supplémentaires expriment Shh et Hoxd-13 Figure 2: Nous observons que lexpression de ces deux gènes napparaît quentre 25 et 48 heures après limplantation de billes FGF2 dans le bourgeon supplémentaire. De plus, on note que lexpression de ces deux gènes est réduite à la zone antérieure du bourgeon supplémentaire, ce qui est inversé en comparaison au bourgeon normal, dans lequel ils sont localisés postérieurement.

19 Discussion Figure 5: Comment une source locale de FGF pourrait initier la formation dun bourgeon de membre ?

20 Lapplication de FGF sur le flanc induit la formation de membre dans une région où les membres ne se forment pas habituellement ; ce qui suggère que lapparition du bourgeon de membre normal nécessite une source locale de FGF. 1) production locale de FGF au niveau axial approprié, cest à dire entre somites n et m. 2) le signal FGF maintient la prolifération des cellules du mésoderme de la plaque latérale, et active les gènes Shh dans les cellules à activité polarisantes potentielles ( région postérieure du bourgeon en formation ). Ce qui crée une région polarisée. ( mais Shh nest pas activé directement par FGF…cf. table 2 )

21 3) Un signal de la région polarisée agit en synergie avec les FGFs pour établir une zone de progression et activer les gènes Hoxd. 4) Les cellules de la zone de progression émettent un signal qui conduit à la formation de la crête ectodermique apicale ( AER ). Ce qui conduit à létablissement dun bourgeon de membre. 5) La partie postérieure de la crête apicale produit FGF-4, qui maintient un état de prolifération continu des cellules de la région polarisée, et de celles du mésenchyme distal de la zone de progression ; qui à son tour maintient lAER, et donc la morphologie du bourgeon.

22 Rappel : dans les bourgeons ectopiques, Shh et Hoxd-13 sont exprimés dans la région antérieure du bourgeon, linverse de la distribution trouvée dans les membres normaux ( postérieure ). Cette expression ectopique corrèle avec la morphologie inversée des doigts. Pour expliquer cette inversion la région de polarisation discrète, située en aval de la région postérieure de celle du bourgeon dun membre normal; Création dun gradient cette fois-ci antéro-postérieur, doù un patron dexpression inversé car celui-ci soriente en respectant la polarité de la région antérieure. Le membre additionnel se caractérise par une polarité inversée

23 Cependant, la formation du membre nest pas normal. En effet, la région exprimant Shh est réduite, ce qui peut sexpliquer par un plus faible gradient de polarisation en comparaison de celui de la région postérieure. De plus les membres ont constate lapparition dun doigts en double (le 3) si le membre supplémentaire est situé dans la partie antérieur ou au milieu du flanc.

24 Lequel des FGF initie le développement des membres dans un embryon normal? Nous avons montré que trois FGF:1, 2 et 4 peuvent induire le développement dun membre, mais aucun deux ne semblent être le signal qui déclenche la formation du bourgeon. le transcrit dFGF4 nest détecté que lorsque le bourgeon est formé. FGF2 est détecté dans le flanc, mais on nobserve pas de formation de membre. FGF8 est exprimé dans lectoderme quand le bourgeon commence à émerger: rôle potentiel dans les stades très précoces du bourgeon. Grâce à des expérience supplémentaires, nous supposons quune stimulation du mésenchyme est requise pour le developpement dun membre supplémentaire.

25 Position et identité des membres: Les résultats suggèrent quune production locale dun FGF contrôle la position des membres, mais la nature du signal activant la production dFGF, et la façon dont cette production est contrôlée sont toujours inconnues. La position à laquelle le signal est produit, peut être encodée par le patron dexpression du gène Hox le long de laxe du corps. Ex: Souris, grenouille et poisson zèbre,les membres supplémentaires se développent au niveau correspondant à la limite antérieur dexpression de Hoxc8.

26 Une explication moléculaire pour linduction dun membre: Tests sur membres damphibiens suggèrent que leur régénération peut être initiée en ajoutant des molécules semblables aux FGF sur le nerf traumatisé. Ainsi la production dun FGF peut être la base moléculaire de la capacité à induire un membre.

27 CONCLUSION : Lapplication locale de FGF sur le flanc dembryon de poulet établit un nouvel axe de croissance proximodistal qui initie le développement dun bourgeon de membre. Et la nature et la morphologie de ce membre est conditionnée par une fenêtre de temps ( stades 13 à 17 ) et de position ( somites 21 à 25 ). Par ailleurs lapplication de FGF dans le mésoderme initie très précocement le mécanisme de développement du membre.(soit active précocement Shh)

28 Mécanisme : FGF maintient dabord un état de prolifération des cellules du mésenchyme, puis active les gènes de Shh dans les cellules polarisantes. Le bourgeon de membre acquiert alors une région polarisante, qui coopère avec FGF pour former une zone de progression. Il sensuit lactivation des gènes Hoxd, et linduction dune crête apicale. Bourgeon de membre LAER sécrète FGF-4 qui exerce un rétrocontrôle positif sur la région polarisée. Ces membres supplémentaires ont une polarité inversée. Aucun des candidats FGF testés ici, ne semble être linitiateur du bourgeon.


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