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Interaction between the Signaling Molecules WNT7a and SHH during Vertebrate Limb Development: Dorsal Signals Regulate Anteroposterior Patterning Interaction.

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1 Interaction between the Signaling Molecules WNT7a and SHH during Vertebrate Limb Development: Dorsal Signals Regulate Anteroposterior Patterning Interaction entre les molécules de signalisation Wnt7a et Shh durant le développement du membre chez les vertébrés : La signalisation dorsal régule la polarisation antéropostérieur Yingzi Yang and Lee Niswander Master 1 BEGuyot Vincent TD BDRame Marion

2 Introduction Description générale de la formation du membre 3 centres sont nécessaires à la croissance et à la formation du membre : La crête au niveau de lectoderme apical Le mésenchyme postérieur Lectoderme dorsal Ces 3 centres contrôlent les 3 axes de polarité: -La crête contrôle la croissance proximodistale. -Le mésenchyme postérieur proximal est impliqué dans la polarité antéropostérieure; cette région du mésenchyme est donc appelée « zone of polarizing activity » (ZPA). -Lectoderme dorsal contrôle la polarité dorsoventrale.

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4 Introduction 2 gènes participent à la signalisation: Fibroblast Growth Factor 4 (FGF4) -crête Sonic Hedgehog (Shh) -mésenchyme postérieur (ZPA) Les patrons poximodistal et antéropostérieur sont mutuellement dépendants: une boucle de rétroaction positive est présente entre FGF4 et Shh.

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6 But de larticle Montrer que linteraction entre FGF4 et Shh peut contrôler la localisation de la ZPA. Démontrer que le signal dorsoventral est requis pour lexpression de Shh, la formation des structures postérieures et la polarité antéropostérieur; et que ce signal est constitué par Wnt7a. Les auteurs proposent un modèle dans lequel la croissance et la formation du membre sont régis par linteraction des signaux provenant des trois axes.

7 FGF4, Shh et la ZPA Matériel et méthode : Hybridation in situ -PCR -Sous-clonage dans le vecteur -Amplification -Récupération des plasmides -Transcription in vitro avec de la digoxygénine -Révélation

8 But : Fonction de FGF4 FGF4, Shh et la ZPA antérieur postérieur proximal distal -LARN de Shh présent dans le mésenchyme postérieur -Restriction de Shh à la partie distale. Stade 24 Stade 26 Stade 20 Lexpression de Shh est perdue dans les cellules perdant linfluence de la crête ou dfgf4

9 Matériel et méthode : Manipulation du membre FGF4, Shh et la ZPA -Incubation à 38°c jusquà obtenir le stade désiré -Petite incision du bourgeon, après enlèvement des membranes -Insertion de la bille -Reincubation (24h) -Fixation (paraformaldehyde) -Hybridation in situ

10 But : Fonction de FGF4 FGF4, Shh et la ZPA -FGF4 est nécessaire pour induire lexpression de Shh contrôle

11 But : Fonction de FGF4 FGF4, Shh et la ZPA -Bmp2, Bmp4 et Hoxd13 sont des cibles directes ou indirectes de la ZPA et sont exprimés près du Shh endogène. -Cela est vérifié de manière ectopique. -Lajout de Shh exogène sans induction par FGF4 ne permet plus lexpression de ces gènes. Shh doit agir conjointement avec FGF4 pour activer ces gènes.

12 Matériel et méthode : manipulation du membre FGF4, Shh et la ZPA -Incubation à 38°c jusquà obtenir le stade désiré -Petite incision du bourgeon, après enlèvement des membranes -Insertion de la bille -Reincubation (24h) -On retire la bille, puis prélèvement dun bout de tissus mésenchymateux et insertion sous la crête antérieur dun membre au stade 19/20 -incubation 6 jours -Fixation (paraformaldehyde) -révélation au bleu alcyan

13 But : Fonction de FGF4 FGF4, Shh et la ZPA Lexpression de Shh, par FGF 4, provoque une activité similaire à la ZPA -Activité polarisante et symétrie -Activité polarisante plus faible

14 But : Fonction de FGF4 FGF4, Shh et la ZPA -Greffe dune progress zone ant. et dune crête (stade 20) près de la bille. -Apparition dun deuxième membre. -Pas de greffe -Seule conséquence : lulna sépaissit La ZPA doit agir avec les cellules dune Progress zone non différenciée pour produire un membre correct.

15 But : rôle du signal ectodermique Le signal dorsoventral et Shh -Distribution inégale de Shh autour de la bille de Fgf4 -Gouttes de PBS dorsales, FGF4 ventral -Shh détecté plus fortement au mésenchyme dorsal Un signal venant de lectoderme dorsal serait nécessaire pour induire lexpression de Shh.

16 Matériel et méthode : Suppression de(s) lectoderme(s) Signal dorsoventral et Shh Suppression de lectoderme dorsal : -application du Nile Blue sulfate (10s) entraînant la formation dune cloque -La cloque est enlevée sans abîmer le mésenchyme sous-jacent Suppression de lectoderme ventral : -On « pèle » lectoderme ventral -Insertion dune pièce de métal pour empêcher ladhésion entre le reste du corps et le bourgeon dénudé

17 But : rôle du signal ectodermique Le signal dorsoventral et Shh Le signal provenant de lectoderme est bien requis en plus de Fgf4 pour induire lexpression de Shh. Ce signal provient de la partie dorsale. Ventral Dorsal

18 But : rôle du signal ectodermique Le signal dorsoventral et Shh Ce signal est-il aussi nécessaire au niveau endogène? Ventral Dorsal -Baisse de lexpression de Shh -Effet mineur

19 But : rôle du signal ectodermique Le signal dorsoventral et Shh -Si on enlève entièrement lectoderme distal et quon ajoute du FGF4 au niveau postérieurpas de Shh. -Si on enlève lectoderme dorsal au niveau distal et quon greffe 3 morceaux de cette partie au niveau antérieur peu ou pas dactivité polarisante. Un signal ectodermique est requis pour maintenir lexpression de Shh endogène aussi bien que lactivité polarisante.

20 But : Mode daction de Shh Le signal dorsoventral et Shh En augmentant le nombre de cellule exprimant Shh on promouvoit la formation des éléments postérieurs. Shh agit donc de manière dose dépendant. -on enlève lectoderme dorsal distal -impossibilité de déterminer la polarité dorsoventrale La perte des éléments du squelettes post peut être reliée à la disparition précoce de Shh. -Shh fourni pour sauvetage du phénotype?

21 Matériel et méthode : greffe de cellule transfectées Wnt7a est le signal ectodermique -Un gène Wnt7a (souris) est souscloné après PCR dans un plasmide. -Des fibroblastes embryonnaires de poulet (CEFs) sont transfectés par un système lipofectine contenant ces plasmides. -Les cellules sont ensuite suspendues dans un petit volume dun milieu qui permet leur agrégation. -Ceci permet dobtenir des agrégats de cellules, qui sont greffés dans le bourgeon.

22 But : Wnt7a est-il le signal ectodermique Wnt7a est le signal ectodermique -La synthèse de Shh est restaurée par Wnt7a -FGF 4 et Wnt7a sont suffisants pour permettre lexpression de Shh.

23 Wnt7a est le signal ectodermique Ni Fgf4 seul, ni Wnt7a seul, ni des cellules transfectés à vide avec une bille de Fgf4 ne permettent le maintient de lexpression de Shh FGF4 cellules non transfectées + Fgf4 But : Wnt7a est-il le signal ectodermique

24 Wnt7a est le signal ectodermique Matériel et méthode : transfection par rétrovirus -Des plamides portant Wnt7a sont souscloné dans des vecteurs rétroviraux -Un stock viral est injecté dans un membre de poulet au stade 19 ou 20.

25 Wnt7a est le signal ectodermique But : Mode de fonctionnement de Wnt7a Wnt7a na pas besoin dêtre exprimé à la surface dorsale pour exercer son effet sur Shh. Dorsal ventral

26 Wnt7a est le signal ectodermique But : test de la restauration du phénotype Wnt7a peut se substituer aux fonctions de lectoderme dorsal dans la régulation de lexpression de Shh et la formation de la polarité antéropostérieur. Wnt7a peut restaurer la polarité antéropostérieur mais ne corrige pas la réduction de la taille des éléments du squelette

27 Rappel des principales conclusions : -FGF4 est nécessaire pour induire lexpression de Shh -Lexpression de Shh, par FGF 4, provoque une activité similaire à la ZPA -Un signal venant de lectoderme dorsal serait aussi nécessaire pour induire lexpression de Shh. -Le signal provenant de lectoderme dorsal est bien requis en plus de Fgf4 pour induire lexpression de Shh, aussi bien que lactivité polarisante. -Wnt7a peut se substituer aux fonctions de lectoderme dorsal dans la régulation de lexpression de Shh et la formation de la polarité antéropostérieur. Discussion

28 -Lectoderme dorsal a un rôle prédominant dans la régulation de Shh et de la ZPA. -Wnt7a influence 2 aspects du développement du membre: il permet la polarisation dorsoventrale, ainsi que le maintient de lexpression de Shh nécessaire pour la polarité antéropostérieure. -Lectoderme ventral influence lui aussi lexpression de Shh mais dans une moindre mesure. Il est possible que le signal dorsal « fort » agisse en combinaison avec le signal ventral plus faible pour maintenir lexpression de Shh dans le mésenchyme postérieur distal. -Wnt7a ainsi que FGF4 sont nécessaires ensemble pour induire et maintenir lexpression de Shh et former le squelette postérieur.

29 Discussion -Le signal provenant de la zone restreinte de la crête sert à confiner la ZPA et Shh dans la partie distale du mésenchyme. En effet, la boucle de rétro action positive entre FGF4 et Shh disparaît proximalement, du fait de léloignement de la crête, source de FGF4. -2 causes possibles à la restriction postérieure du Shh: Lexpression de Shh dépend de létat des cellules ou de lhistorique de leur développement. Un signal additionnel peut aussi être nécessaire, là où se combinent les cellules dorsales et ventrales de lectoderme (marge postérieure), et celles postérieures. -La ZPA se forme au niveau de la zone dinteraction des trois protéines. La croissance proximodistale, lorientation antéropostérieur et dorsoventrale sont le fait dinteractions réciproques entre ces 3 protéines, notamment grâce à la ZPA.


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