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I.Les premières avancées sur la GFP (in vivo) A. La découverte dun chercheur B. Les protéines responsables de la fluorescence II. Structure, Chromophore.

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2 I.Les premières avancées sur la GFP (in vivo) A. La découverte dun chercheur B. Les protéines responsables de la fluorescence II. Structure, Chromophore et Mutants A. La structure et le chromophore B. La création des différents mutants III. Les applications possibles de la GFP A. Les diverses applications B. Un vecteur dexpression fondamental

3 I.Les premières avancées sur la GFP (in vivo) Osamu Shimomura 1960: Doctorat en chimie organique à lUniversité de Nagoya (Japon) Isole une protéine responsable de la brillance chez le mollusque Cypridina Frank Johnson (Université de Princeton, New Jersey) 1961: début des travaux sur une méduse bioluminescente

4 I.Les premières avancées sur la GFP (in vivo) Aequorea victoria (« cristal jelly ») Côtes du Nord-Ouest du Pacifique Organisme bioluminescent Particularité: émission dune lumière verte à la base de lombrelle (anneau) Travail sur spécimens

5 I.Les premières avancées sur la GFP (in vivo) Protéine bioluminescente ou photoprotéine Inhibition réversible à certains pH Organes lumineux (anneaux) Extrait (pH 4) Extrait (pH neutre) Forte luminescence Faible luminescence Pas de luminescence tampon pH4 filtration NaHCO 3 Eau de mer soit Ca 2+

6 I.Les premières avancées sur la GFP (in vivo) 1962: extraction de 2 protéines Aequorine: 465 nm - apo-aequorine (189 aa, 21KDa) - O moléculaire - chromophore « coelenterazine » (423Da) GFP 508 nm Pourquoi la méduse ne sirradie que de vert? 2

7 I.Les premières avancées sur la GFP (in vivo) 1969: aequorine AF-350 (coelenteramine) 1972: Dénaturation (urée + 2-mercaptoéthanol) 2-aminopyrazine (Cypridina)

8 O2O2 O2O2 O2O2 I.Découverte de la GFP et sa fluorescence * Ca 2+ O2O2 Aequorine (coelenterazine) Aequorine CO 2 GFP 2X Aequorine (coelenteramide) Apoaequorine

9 I.Les premières avancées sur la GFP (in vivo) GFP: réaction de fluorescence 1979: découverte du chromophore de la GFP et de sa structure 10 décembre 2008: Prix Nobel de Chimie

10 II.Structure, Chromophore et Mutants 238 Acides aminés, dont 3 formant le chromophore: la sérine 65, la tyrosine 66 et la glycine 67.

11 II.Structure, Chromophore et Mutants 11 Feuillets β, 4 hélices α, et une formation en baril.

12 II.Structure, Chromophore et Mutants Chromophore

13 Cyclisation Déshydratation Oxydation

14 II.Structure, Chromophore et Mutants Premier mutant : le « Timer »

15 II.Structure, Chromophore et Mutants Autres mutants: les variantes de couleurs

16 II.Structure, Chromophore et Mutants Utilisation: le multi-marquage

17 III. Les applications possibles de la GFP 2008: Prix Nobel de Chimie 1990: Insertion de la GFP chez E.coli 1988: Séquençage de la GFP Martin Chalfie Expression de la GFP dans E.coli, sous lumière UV

18 III. Les applications possibles de la GFP Marquage cellulaire : Insertion du gène codant la GFP dans une cellule (transfection) Tri des cellules (transformées ou non) par cytométrix en flux

19 III. Les applications possibles de la GFP Marquage moléculaire : Synthèse dune protéine de fusion (protéine dintérêt/GFP) Suivi de la protéine de fusion par microscopie à fluorescence

20 III. Les applications possibles de la GFP Gène rapporteur : Synthèse dune protéine possédant une activité connue et détectable (par exemple la fluorescence). Etude de lefficacité de promoteurs spécifiques, et les facteurs influant sur lexpression dun gène dintérêt Vecteur de clonage : Expression et multiplication dun fragment dintérêt dans un hôte. Production à grande échelle de protéines (hormones de croissance par exemple)

21 EGFP CMV pUC ori Kan MCS Fragment dintérêt III. Les applications possibles de la GFP SV 40 Poly A

22 III. Les applications possibles de la GFP C. Elegans C. Elegans produisant la protéine de fusion MIAM !

23 III. Les applications possibles de la GFP Après insertion de la GFP et de ses mutants au sein de différentes bactéries (Roger Tsien)


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