La GFP: Le cadeau de la méduse

Présentation au sujet: "La GFP: Le cadeau de la méduse"— Transcription de la présentation:

1 La GFP: Le cadeau de la méduse

2 I. Les premières avancées sur la GFP (in vivo)
A. La découverte d’un chercheur B. Les protéines responsables de la fluorescence II. Structure, Chromophore et Mutants A. La structure et le chromophore B. La création des différents mutants III. Les applications possibles de la GFP A. Les diverses applications B. Un vecteur d’expression fondamental

3 I. Les premières avancées sur la GFP (in vivo)
Osamu Shimomura 1960: Doctorat en chimie organique à l’Université de Nagoya (Japon) Isole une protéine responsable de la brillance chez le mollusque Cypridina Frank Johnson (Université de Princeton, New Jersey) 1961: début des travaux sur une méduse bioluminescente

4 I. Les premières avancées sur la GFP (in vivo)
Aequorea victoria (« cristal jelly ») Côtes du Nord-Ouest du Pacifique Organisme bioluminescent Particularité: émission d’une lumière verte à la base de l’ombrelle (anneau) Travail sur spécimens

5 I. Les premières avancées sur la GFP (in vivo)
Protéine bioluminescente ou photoprotéine Inhibition réversible à certains pH Organes lumineux (anneaux) Faible luminescence tampon pH4 filtration Pas de luminescence Extrait (pH 4) NaHCO 3 Faible luminescence Extrait (pH neutre) Eau de mer soit Ca 2+ Forte luminescence

6 I. Les premières avancées sur la GFP (in vivo)
1962: extraction de 2 protéines Aequorine: nm - apo-aequorine (189 aa, 21KDa) O moléculaire - chromophore « coelenterazine » (423Da) GFP nm Pourquoi la méduse ne s’irradie que de vert? 2

7 I. Les premières avancées sur la GFP (in vivo)
1969: aequorine AF-350 (coelenteramine) 1972: Dénaturation (urée + 2-mercaptoéthanol) 2-aminopyrazine (Cypridina)

8 I. Découverte de la GFP et sa fluorescence
Aequorine (coelenteramide) 2X Ca2+ O2 GFP O2 O2 * Ca2+ CO2 Aequorine Aequorine (coelenterazine) O2 Apoaequorine Ca2+

9 I. Les premières avancées sur la GFP (in vivo)
GFP: réaction de fluorescence 1979: découverte du chromophore de la GFP et de sa structure 10 décembre 2008: Prix Nobel de Chimie

10 II. Structure, Chromophore et Mutants
238 Acides aminés, dont 3 formant le chromophore: la sérine 65, la tyrosine 66 et la glycine 67.

11 II. Structure, Chromophore et Mutants
11 Feuillets β, 4 hélices α, et une formation en baril.

12 II. Structure, Chromophore et Mutants
Structure tertiaire GFP Chromophore

13 Cyclisation Déshydratation Oxydation

14 II. Structure, Chromophore et Mutants
Premier mutant : le « Timer »

15 II. Structure, Chromophore et Mutants
Autres mutants: les variantes de couleurs

16 II. Structure, Chromophore et Mutants
Utilisation: le multi-marquage

17 III. Les applications possibles de la GFP
Martin Chalfie 1988: Séquençage de la GFP 1990: Insertion de la GFP chez E.coli 2008: Prix Nobel de Chimie Expression de la GFP dans E.coli, sous lumière UV

18 III. Les applications possibles de la GFP
Marquage cellulaire : Insertion du gène codant la GFP dans une cellule (transfection) Tri des cellules (transformées ou non) par cytométrix en flux

19 III. Les applications possibles de la GFP
Marquage moléculaire : Synthèse d’une protéine de fusion (protéine d’intérêt/GFP) Suivi de la protéine de fusion par microscopie à fluorescence

20 III. Les applications possibles de la GFP
Gène rapporteur : Synthèse d’une protéine possédant une activité connue et détectable (par exemple la fluorescence). Etude de l’efficacité de promoteurs spécifiques, et les facteurs influant sur l’expression d’un gène d’intérêt Vecteur de clonage : Expression et multiplication d’un fragment d’intérêt dans un hôte. Production à grande échelle de protéines (hormones de croissance par exemple)

21 III. Les applications possibles de la GFP
CMV MCS pUC ori EGFP Fragment d’intérêt SV 40 Poly A Kan pEGFP – N1

22 III. Les applications possibles de la GFP
MIAM ! C. Elegans produisant la protéine de fusion C. Elegans

23 III. Les applications possibles de la GFP
Après insertion de la GFP et de ses mutants au sein de différentes bactéries (Roger Tsien)