Prix Nobel de Chimie 2008 Découverte et utilisation de la Green Fluorescent Protein Osamu Shimomura, Martin Chalfie, Roger Tsien.

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1 Prix Nobel de Chimie 2008 Découverte et utilisation de la Green Fluorescent Protein Osamu Shimomura, Martin Chalfie, Roger Tsien

2 Une petite méduse verdâtre!
Plus d’eau que dans une bière! Cellules urticantes Aequorea sp.

3 Osamu Shimomura Marine Biological Laboratory, Boston Etude de la bioluminescence d’Aequorea

4 La bioluminescence Emission de lumière par des organismes vivants
Chémoluminescence biologique

5 Une réaction bioluminescente
OH OH CO2 Luciférase (protéine) O N N N N O 2 N H N H HO HO H L u c i f é r i n e

6 Le système luminescent d’Aequorea Shimomura & Johnson, 1960s
Aequorine: Photoprotéine Ca2+-dépendante Photo : Protein data bank Head, Inouye, Shimomura. Nature 2000

7 Utilisation de l’aequorine
Brini et al 1999

8 Cinétique du calcium dans des embryons
Figure Images of Ca2+ waves in gastrulating zebrafish embryos detected by microinjected f-aequorin (recombinant aequorin reconstituted with the coelenterazine f luminophore (C6779)). The images are pseudocolored to represent Ca2+-dependent luminescent flux in (photons/pixel/second × 10-2) according to the color scales shown at the left of each of the three time-lapse image sequences (a,b,c). Time in seconds is indicated in the lower left-hand corner of each frame. The sequences depict three different spatial wave types that are represented schematically at the end of each sequence. PM indicates the dorsal midline pacemaker; its position in the luminescence images is marked by a red asterisk. The image was contributed by Edwin Gilland, Marine Biological Laboratory, Woods Hole, MA, and reproduced with permission from Proc Natl Acad Sci U S A 96, 157 (1999).

9 La découverte de la GFP Osamu Shimomura,1962
“A protein giving solutions exhibiting a very bright, greenish fluorescence in the ultraviolet ... has also been isolated from squeezates.” (Shimomura et al. 1962).

10 nm 504 nm J.Wiedenmann, S. Ivanchenko, F. Oswald, F. Schmitt, C. R!cker, A. Salih, K. D. Spindler, G. U. Nienhaus, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2004, 101,

11 Campbell, 2008. Scholarpedia
Le chromophore Campbell, Scholarpedia

12 GFP: le vert intense Ions calcium

13 A la fois mine.... et alarme antivol!

14 Le clonage de la GFP Douglas Prasher, 1992 Woods Hole Oceanographic Institution

15 La séquence de la GFP

16 L’expression de la GFP chez Caenorhabditis Martin Chalfie, 1994 Columbia University

17 Caenorhabditis elegans
nématode transparent 1 mm de long, 1031 cellules Prix Nobel de Médecine Sydney Brenner, John Sulston, Bob Horvitz

18 Un travail fondateur Science 1994

19 Formation autocatalytique du chromophore
Campbell, Scholarpedia

20 Réaliser des protéines de fusion

21 Les avantages de la GFP comme marqueur cellulaire
Non-toxique Absence de cofacteur Stabilité Peu d’interactions avec constituants cellulaires

22 Des outils pour suivre la progression d’un cancer
3 semaines 5 semaines 9 semaines

23 Une nouvelle vision des cellules
Intervalles de 2 sec - RFP séquence adressage mito Hamamatsu.com

24 Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP)

25 Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP)
Pre bleach 15 sec 75 sec 300 sec Fusion GFP-E-cadherin Cliffe et al. 2004

26 Les mutants colorés Roger Tsien, 1996 University of California

27 Variants colorés de la GFP
Environnement chromophore

28 Campbell, 2008. Scholarpedia
Chromophores mutants Campbell, Scholarpedia

29 Des variations de λ d’excitation et d’émission
Trugnan et al 2004

30 De nombreuses applications
Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET)

31 FRET: la protéine Caméléon

32 Protéine Caméléon Cellule HELA Hamamatsu.com

33 Marquages multiples des cellules
Tubuline - et Histone - 7 min entre images - rein porc

34 Une palette d’applications

35 Les FP chez des organismes non-bioluminescents
Acropora

36 Une structure similaire au nidogen-1
10% d’homologie de séquence mais très gde similarité structurale! Les sites conservés fixent le collagène IV et le Perlecan, des protéines importantes des mbs basales des cellules. GFP Nidogen Hopf et al 2001

37 Le nidogen-1 Böse et al 2006 Hopf et al 2001
Des souris mutantes présentent des anomalies de développement des membres. Fusion des doigts. Böse et al 2006 Hopf et al 2001

38 Une méduse devenue princesse
Révolution en biologie cellulaire Une richesse inouïe d’applications Des perspectives éblouissantes!

39 The future is bright!

40 Chromophores naturels
GFP UV UV Campbell, Scholarpedia