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Le système de sécrétion de type II chez V. cholerae Melissa PETITI M2 MBVB Sécrétion des facteurs de virulence et relation bactéries-hôtes.

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1 Le système de sécrétion de type II chez V. cholerae Melissa PETITI M2 MBVB Sécrétion des facteurs de virulence et relation bactéries-hôtes

2 Vibrio cholerae Bactérie gram – 1 flagelle polaire Sécrétion de la toxine cholérique Introduction Figure 1 : V. cholerae observées au microscope électronique

3 Le système de sécrétion de type 2 Prise en charge des protéines après translocation dans le périplasme via Sec/Tat Complexe inséré dans les deux membranes Analogie avec le Pilus de type IV Introduction Figure 2 : Modèle de sécrétion des protéines via le SST2 Chez P. aeruginosa (Voulhoux et al. 2001)

4 Modèle du SST2 chez V. cholerae Complexe protéique codé par les gènes eps EpsD : sécrétine EpsE : ATPase de trafic EpsG : pseudopilus ( + Eps HIJK ) EpsM, L, C et F : plateforme de membrane interne Introduction Figure 3 : Modèle du SST2 chez V. cholerae

5 2001 : le complexe SST2 est localisé au pôle cellulaire Figure 4 : Localisation des protéines de fusion pGFP-EpsL et pGFP-EpsM (Scott et al. 2001) Figure 5 : Microscopie à fluorescence en temps réel pour la protéine de fusion pGFP-EpsM (Scott et al. 2001) Partie 1

6 EpsM est-elle localisée au pôle de la cellule ? Observer la localisation cellulaire des protéines codées par les gènes eps Fusion des protéines dintérêt à la GFP Expression à partir dun plasmide avec et sans induction dans une souche mutante 1 : Localisation cellulaire de la protéine pGFP-EpsM

7 La distribution native dEpsM nest pas aux pôles cellulaires Induction à lIPTG : Foyers de fluorescence aux pôles de la cellules Sans induction : Fluorescence visible à la périphérie de la cellule 1 : Localisation cellulaire De la protéine pGFP-EpsM Figure 6 : Localisation cellulaire de la protéine chimère pGFP-EpsM dans une souche mutante epsM

8 Localisation des protéines chimères exprimées à partir du chromosome Observer la localisation cellulaire des protéines GFP-Eps produites à partir du chromosome copies chromosomiques des gènes eps remplacées par les copies fusionnées à la GFP (souches gfp-epsC et gfp-epsM) vérifier la production des protéines vérifier la fonctionnalité du système avec ces fusions Partie 2

9 Les protéines de fusion GFP-EpsM et GFP-EpsC sont produites Figure 7 : Western blot indiquant la production des protéines chimères 2 : Localisation des protéines chimères exprimées à partir du chromosome 1 : souche WT 2: gfp-epsM 1 : souche WT 2: gfp-epsC

10 Les protéines de fusion GFP-EpsM et GFP-EpsC sont produites Figure 7 : Western blot indiquant la production des protéines chimères 2 : Localisation des protéines chimères exprimées à partir du chromosome GFP-EpsC GFP-EpsM 1 : souche WT 2: gfp-epsC 1 : souche WT 2: gfp-epsM

11 Les protéines de fusion GFP-EpsM et GFP-EpsC sont produites Figure 7 : Western blot indiquant la production des protéines chimères 2 : Localisation des protéines chimères exprimées à partir du chromosome GFP-EpsM EpsC GFP-EpsC EpsM 1 : souche WT 2: gfp-epsC 1 : souche WT 2: gfp-epsM

12 Les fusions gfp-epsC et gfp-epsM sont fonctionnelles Mesure de lactivité des protéases sécrétées par V. cholerae via le SST2. Les protéines de fusion sont des composants fonctionnels du SST2 2 : Localisation des protéines chimères exprimées à partir du chromosome Tableau 1 : Mesure de lactivité protéase des souches WT et possédant les fusions

13 Les protéines chimères sont localisées à la périphérie cellulaire GFP-EpsM : 3,2 foyers / cellule GFP-EpsC : 5,3 foyers / cellule 2 : Localisation des protéines chimères exprimées à partir du chromosome Figure 8 : localisation cellulaire des protéines de fusion GFP-EpsC et GFP-EpsM produites à partir du chromosome

14 Les protéines chimères sont localisées à la périphérie cellulaire GFP-EpsM : 3,2 foyers / cellule GFP-EpsC : 5,3 foyers / cellule 2 : Localisation des protéines chimères exprimées à partir du chromosome Figure 8 : localisation cellulaire des protéines de fusion GFP-EpsC et GFP-EpsM produites à partir du chromosome

15 Les protéines chimères sont localisées à la périphérie cellulaire GFP-EpsM : 3,2 foyers / cellule GFP-EpsC : 5,3 foyers / cellule 2 : Localisation des protéines chimères exprimées à partir du chromosome Figure 8 : localisation cellulaire des protéines de fusion GFP-EpsC et GFP-EpsM produites à partir du chromosome

16 Les foyers de fluorescences correspondent-ils aux complexes SST2 ? Observer la co-expression des protéines natives et chimères. souche gfp-epsM + pEpsM souche gfp-epsC + pEpsC Partie 3 Construction de souches dans lesquelles lopéron eps est sous le contrôle dun promoteur inductible Introduction des fusions gfp-epsC et gfp-epsM sur le chromosome P BAD ::eps gfp-epsC P BAD :: eps gfp-epsM

17 Les protéines natives ont remplacé les protéines chimères dans le complexe Signal GFP diffus dans les cellules Absence de foyers distincts de fluorescence 3 : Les foyers de fluorescence correspondent-ils aux complexes SST2 ? Figure 9 : localisation cellulaire des protéines GFP-EpsC et GFP-EpsM dans des souches contenant respectivement les plasmides pEpsC et pEpsM A B

18 Le nombre de foyers et le taux de sécrétion augmentent avec le niveau dexpression Figure 10 : localisation cellulaire des protéines GFP-EpsC et GFP-EpsM avec ou sans induction du promoteur pBAD Figure 11 : quantification des foyers de fluorescence et mesure de lactivité protéase correspondante x7 3 : Les foyers de fluorescence correspondent-ils aux complexes SST2 ?

19 Les modèles précédents sont-ils fidèles à la distribution WT des protéines Eps Localisation du complexe SST2 par immunofluorescence Anticorps anti-EpsC Anticorps anti-EpsG 3 : Les foyers de fluorescence correspondent-ils aux complexes SST2 ?

20 EpsG est distribuée à la périphérie des cellules Figure 12 : Localisation de la protéine EpsG native par immunofluorescence dans une souche WT et une souche ΔepsG 3 : Les foyers de fluorescence correspondent-ils aux complexes SST2 ? WT Δ epsG

21 Comment sassemble la machinerie SST2 ? Relation entre le cytosquelette bactérien et le SST2 inhibition des filaments MreB et observer leffet sur le SST2 Rôle dancrage, darrimage du complexe ? Mutations des gènes eps dans les souches gfp-epsC et gfp-epsM observer leffet de ces mutations sur la sécrétion des protéines observer leffet de ces mutations sur la localisation des protéines chimères Partie 4

22 MreB forme des filaments hélicoïdaux qui structurent la cellule 4 : Comment sassemble la machinerie SST2 ? Figure 13 : Localisation cellulaire de MreB (Jones et al. 2001)

23 Le SST2 sassemble indépendamment des filaments MreB Figure 14 : Localisation cellulaire de GFP-EpsC et croissance bactérienne après traitement de la souche gfp-epsC au A22 Figure 15 : Effet du A22 sur le niveau de sécrétion 4 : Comment sassemble la machinerie SST2 ? ExtB

24 Les mutations affectent la fonction du complexe SST Lactivité protéase est restaurée lorsque lon complémente la mutation Le complexe retrouve sa fonction de sécrétion Tableau 2 : Mesure de lactivité protéase dans le surnageant de culture de souches mutantes et complémentées 4 : Comment sassemble la machinerie SST2 ?

25 Les mutations affectent la fonction du complexe SST Lactivité protéase est restaurée lorsque lon complémente la mutation Le complexe retrouve sa fonction de sécrétion Tableau 3 : Mesure de lactivité protéase dans le surnageant de culture de souches mutantes et complémentées 4 : Comment sassemble la machinerie SST2 ?

26 EpsD est requise pour un assemblage focal dEpsC Figure 16 : Localisation cellulaire de GFP-EpsC dans des souches mutantes eps 4 : Comment sassemble la machinerie SST2 ? ΔepsD : fluorescence diffuse

27 EpsM et EpsL stabilisent EpsC à la périphérie de la cellule Figure 16 : Localisation cellulaire de GFP-EpsC dans des souches mutantes eps 4 : Comment sassemble la machinerie SST2 ? ΔepsM ou ΔepsL : fluorescence aux pôles en phase stationnaire

28 EpsM requière EpsC pour sa localisation Figure 17 : Localisation cellulaire de GFP-EpsM dans des souches mutantes eps 4 : Comment sassemble la machinerie SST2 ? ΔepsC : fluorescence diffuse

29 EpsM requière EpsD et EpsC pour sa localisation Figure 17 : Localisation cellulaire de GFP-EpsM dans des souches mutantes eps 4 : Comment sassemble la machinerie SST2 ? ΔepsD : fluorescence diffuse

30 EpsD, EpsC et EpsL sont requises pour la localisation correcte dEpsM Figure 17 : Localisation cellulaire de GFP-EpsM dans des souches mutantes eps 4 : Comment sassemble la machinerie SST2 ?

31 Les protéines EpsM et EpsC sont partiellement colocalisées Figure 17 : Colocalisation des protéines GFP-EpsM et mCherry-EpsC dans une souche WT de V. cholerae 11% de foyers jaunes : complexes SST2 assemblés. Foyers verts ou rouges : complexes dont lassemblage nest pas terminé. 4 : Comment sassemble la machinerie SST2 ?

32 Enfin un premier modèle dassemblage du SST2 ! 2009 : Première publication au sujet de lassemblage du SST2 Localisation membranaire latérale Importance de la stœchiométrie entre les partenaires Mise en évidence dun modèle dassemblage Conclusion

33 Modèle dassemblage EpsD semble être linitiateur de la formation du complexe EpsC sassocie pour former un complexe mais interaction directe ? EpsL et EpsM sassembleraient ensuite et EpsM stabiliserait cette interaction Conclusion

34 Pour aller plus loin Étude des interactions protéine/protéine physique (co-IP, double hybride) Etude interactions protéine/protéine par fluo (dynamique) Conclusion

35 Merci de votre attention !


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