La présentation est en train de télécharger. S'il vous plaît, attendez

La présentation est en train de télécharger. S'il vous plaît, attendez

Méthodes détude de la localisation subcellulaire dune protéine Figure 1: Localisation par fluorescence de la tubuline et de lADN dans des cellules végétales.

Présentations similaires


Présentation au sujet: "Méthodes détude de la localisation subcellulaire dune protéine Figure 1: Localisation par fluorescence de la tubuline et de lADN dans des cellules végétales."— Transcription de la présentation:

1 Méthodes détude de la localisation subcellulaire dune protéine Figure 1: Localisation par fluorescence de la tubuline et de lADN dans des cellules végétales de tabac. (daprès Inserm)

2 I Localisation subcellulaire dune protéine par observation au microscope électronique à transmission 1) Lautoradiographie Un atome radioactif se trouve incorporé dans une protéine de la cellule et sert de traceur (marquage au tritium le plus souvent). La détection de la radioactivité incorporée se fait ensuite par lapplication dune émulsion photographique sur la coupe: le rayonnement émis par les atomes radioactifs impressionne lémulsion qui est alors révélée comme un film photographique. Les grains dargent métallique sont localisés au dessus des structures ayant incorporé les atomes radioactifs.

3 Expérience de Jamieson et Palade Suivi à la leucine tritiée, grains de zymogène radioactifs. 3 minutes: grains dargent sur le RE 20 minutes: grains dargent sur lappareil de Golgi 90 minutes: grains dargent sur les vésicules sécrétrices Figure 2: Suivi de lexocytose des grains de zymogène. (daprès le Alberts)

4 2) La cytoenzymologie Localisation dune enzyme à léchelle subcellulaire via la visualisation des produits de la réaction quelle catalyse. 3) Limmunocytochimie Localisation de lanticorps spécifique dune protéine donnée par couplage à une molécule opaque aux électrons: une bille dor. (localisation par immunogold).

5 II Localisation subcellulaire dune protéine via la fluorescence 1)Limmunofluorescence Localisation de lanticorps spécifique de la protéine, donc localisation de la protéine. Obtention des anticorps spécifiques par injection de la protéine donnée à un lapins et récupération et purification des anticorps alors produits. Couplage des anticorps à un fluorophore pour observation au microscope confocal (couplage à lanticorps primaire ou à un anticorps secondaire).

6 Localisation des microtubules Les microtubules du cytosquelette sont mis en évidence grâce à un anticorps dirigé contre la tubuline. Le protocole dimmunofluorescence a comporté deux étapes : - reconnaissance de la tubuline par un anticorps anti-tubuline (anticorps 1) - repérage par un deuxième anticorps fluorescent dirigé contre lanticorps 1 Figure 3: Observation au microscope confocal de microtubules (CNRS)

7 2)Localisation via la GFP Emission de fluorescence à partir dun ADN recombinant: promoteur du gène suivi de la séquence codante du gène sans son codon stop directement suivi de la séquence codante du gène de méduse Aequorea victoria codant la GFP. Transcription et traduction classique aboutissant à une protéine fonctionnelle à laquelle est fusionnée la GFP.

8 Figure 4: Cellule souche mésenchymateuse observée au microscope confocal Les microtubules sont associés à la GFP et les histones 2b sont associés à la RFP.

9 III Avantages et inconvénients Autoradiographie: nécessité de fixer les cellules, pas de vision en dynamique. Immunofluorescence indirecte: observation de la cellule en dynamique, et phénomène damplification du signal possible. Mais appréciation de la fluorescence subjective. Par la GFP, localisation in vivo des protéine, patron dexpression du gène dans le temps et lespace… Mais recombinaison pas toujours efficace.


Télécharger ppt "Méthodes détude de la localisation subcellulaire dune protéine Figure 1: Localisation par fluorescence de la tubuline et de lADN dans des cellules végétales."

Présentations similaires


Annonces Google