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1 Principes dImmuno-histo-chimie et dImmunofluorescence : (P. Levillain)

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1 1 Principes dImmuno-histo-chimie et dImmunofluorescence : (P. Levillain)

2 2 Principes généraux Mise en évidence dun constituant cellulaire ou tissulaire par une réaction antigène anticorps On utilise un anticorps connu qui est dirigé contre un antigène que lon recherche sur la préparation histologique ou cytologique Puis on met en évidence la fixation éventuelle de lanticorps sur la lame par un chromogène (IHC) ou un fluorochrome (IF)

3 3 1 - LES ANTICORPS

4 4 Les anticorps primaires (ou spécifiques) Ce sont les anticorps utilisés pour mettre en évidence la présence de lantigène recherché Il en existe deux types : –Les AC polyclonaux –Les AC monoclonaux

5 5 Production danticorps par des animaux hyper-immunisés ANTICORPS POLYCLONAUX

6 6 Technique des hybridomes ANTICORPS MONOCLONAUX

7 7 Milieu HAT Hypoxanthine Aminoptérine Thymidine Laminoptérine bloque une voie métabolique qui peut être contournée par lutilisation dhypoxanthine et de thymidine sauf par les cellules du myélome

8 8 Anticorps Polyclonaux : Inconvénients : spécificité relative et variable selon le lot Avantages : 1) coût généralement moins élevé 2) plusieurs épitopes reconnus => marquage plus intense Monoclonaux : - spécificité définie - cette spécificité peut entraîner une moindre sensibilité en cas daltération des épitopes

9 9 Antigènes masqués par la fixation Restauration antigénique –Chauffage des coupes histologiques (autocuiseur, bain marie, micro-ondes) –Dans une solution acide ou alcaline selon lanticorps utilisé

10 10 2 – LA REVELATION DU COMPLEXE ANTIGENE - ANTICORPS Immunofluorescence

11 11 Immunofluorescence directe fluorochrome

12 12 Immunofluorescence à deux étages fluorochrome

13 13 Microscope à fluorescence (épi-illumination)

14 14 Différents types de fluororochromes

15 15 Fluorochrome Immunofluorescence : Résumé Cryocut Sérums utilisés Dépôts des sérums sur lames DIRECTE INDIRECTE Incubation en chambre humide

16 16 Immuno-histo-chimie et Immuno-cyto-chimie

17 17 Anticorps primaire conjugué péroxydase

18 18 PAP

19 19 Autres techniques de révélation

20 20 Streptavidine biotine

21 21 Polymères (type Envision)

22 22 Application (méthode streptavidine-biotine) Prélèvements pour histologie standard + IFD en congélation Préparation des Coupes En congélation: 3 à 4 microns, +/- fixation acétone, séchage, rinçage En paraffine: lames blanches 4 µm puis déparaffinage manuel bains dalcool successifs puis démasquage antigénique (auto-cuiseur)

23 23 Application (méthode streptavidine-biotine) Technique de révélation classique « streptavidine-biotine- peroxydase » ETAPESTEMPS DINCUBATION Agent bloquant les enzymes endogènes : H2O2 3% 5 min Anticorps primaire : 1 Variable : de une heure à une nuit Réactif secondaire biotinylé (Linker) : 2 15 min Streptadidine-peroxydase Substrat ( DAB) : 3 5min Hématoxyline3 min

24 24 Résumé du protocole DéparaffinageDémasquageCrayon hydrophobe Anticorps primaire puis AC secondaire biotinylé Streptavidine- peroxydase Substrat + DABHématoxylineMontage des lames

25 25 Polymères Technique EnVision : amplification par molécule « porteuse » ETAPESTEMPS DINCUBATION Agent bloquant les enzymes endogènes : H2O2 5 min Anticorps primaire (souris ou lapin) Variable : jusquà une nuit Polymère marqué à la HRP (peroxydase de raifort) 30 min Substrat-Chromogène 3,3- diaminobenzidine (DAB+) 5 min Contre-coloration à lHématoxyline 3 min

26 26 Résumé polymère (Kit EnVision) Étape 1 : Blocage des péroxydases endogènes Étape 2 : Anticorps primaire Étape 3 : Polymère marqué à la HRP Étape 4 : Substrat chromogène Étape 5 : Contre coloration à lhématoxyline Incubation

27 27 Technique du double marquage

28 28 Technique de double marquage en microscopie optique On doit utiliser deux enzymes différentes

29 29 IM et IHC comparaison Difficultés et limites

30 30 IMMUNO-FLUORESCENCE : Avantage : faible coût et technique facile et rapide mais- ne permet pas la conservation des lames - peu informative sur la morphologie IMMUNO-HISTOCHIMIE : - permet dapprécier la morphologie des lésion - permet la conservation des lames IF / IHC

31 31 Fixation/Congélation Type dantigèneTissu fixéTissu congelé Ag extra cellulaire +/-+ Ag membranaireSvt -+ Ag intra cellulaire++

32 32 PB = extra cellulaire

33 33 Vascularite

34 34 HMB 45 Marqueur des mélanosomes (cytoplasmique) Chromogène : fast red

35 35 RP et noyaux

36 36 Difficultés liées à la technique Fluorescence : - découplage du fluorochrome (bruit de fond) (=> diminution bruit de fond par Bleu Evans) - fluorescence spontanée (f. élastiques, glandes sudorales…) - fixation sur des protéines dorigine sérique (lupus) - fixation par des protéines électronégatives (donc tamponner en pH alcalin, bloquer les sites) - « fading » (conservation au froid et obscurité, lecture rapide, montage en milieu alcalin et glycériné)

37 37 Difficultés liées à la technique IHC : - peroxydases endogènes - biotines endogènes - zones de nécrose - absorption passive (histiocytes)

38 38 Difficulté non liée à la technique - un antigène peut posséder un ou plusieurs épitopes en commun avec un autre Ag (réactions croisées) - CD 10 (cALLA) et cellules du rein - CD 56 (NCAM) cellules NK et tumeurs neuroendocrines


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