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Visualization of the intracellular behavior of HIV in living cells.

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1 Visualization of the intracellular behavior of HIV in living cells

2 Cycle du VIH Règne : virus Groupe VI : ssRNA RT Famille : Retroviridae Sous-famille : Orthoretrovirinae Genre : Lentivirus Virus de limmunodéficience humaine

3 Introduction Pour atteindre le pore nucléaire, traversée du cytoplasme Diffusion des particules est limitée : viscosité du cytoplasme Moyen de transport : le cytosquelette, not. les dynéines le long des microtubules. Objectif de létude : grâce à la fluorescence Caractérisation du trafic intracellulaire permettant de détecter des complexes dorigine virale Observation du mouvement du virion dans la cellule Observation des interactions du VIH avec les éléments cytoplasmiques

4 Production virale CoTransfection de cellules 293 T avec pLAI- Yu (DNA proviral) peGFPC3 Collecte du surnageant contenant les virus Suivi du virus suivi de la GFP-Vpr (Vpr reste associée à lADN viral) Vpr : protéine accessoire du VIH Incorporation Vpr – GFP par interaction avec la région gag p6 pendant lassemblement viral peGFPC3 GFP Vpr P P Gènes proviraux pLAI- Yu

5 Exposition cellule cible (exprimant le CD4) avec surnageant Observation de la fluorescence Infection précoce Signaux dans toute la cellule Après 2h dincubation Accumulation du signal GFP dans la région péri nucléaire, au niveau des MTOC + Ac anti-tubuline (rouge)

6 Utilisation de la GFP : technique fiable? Surnageant des cellules transfectées Fixation des particules virales Ac anti p17 MA (protéine de matrice) Ac anti p24 CA (protéine de la capside) Co-fixation de GFP-Vpr avec p24 ou p17 (protéines gag) ds % des cas (flèches). Ccl : Détection possible de plus de la ½ des virions grâce à la GFP.

7 Cellules transfectées + DiD (colorant des membranes) Collecte du surnageant (virus) Fixation Co-localisation GFP-Vpr- DiD Ccl : GFP-Vpr co-localise avec les membranes cellulaires enveloppant le virion. But : montrer que GFP-Vpr est incorporé dans les virions infectieux

8 Transfection de cellules par constructions plasmidiques Collecte virions Fractionnement sur gradient Précipitation TCA SDS PAGE Western Blot Ac anti p24 Ac anti GFP Fractions Lysat de cellules transfectées avec GFP Co-purification Vpr-GFP avec p24 CA = incorporation spécifique dans les particules virales Ccl : incorporation de la GFP-Vpr ds les virions intacts Pas dassociation non spécifique

9 Le VIH utilise le cytosquelette pour se déplacer dans la cellule (1) Infection cellules HeLa (CD4/CCR5) avec HIV (GFP-Vpr) Mitochondries=structure cellulaire Mouvement de 5 particules Progression du VIH Trajectoire curviligne vers le noyau. Trajectoire du virus

10 Quantification du mvt des 5 particules : Migration nucléaire relative=b/(a+b) Le VIH utilise le cytosquelette pour se déplacer dans la cellule (2) Mesure de la position des part.virales ttes les 5 min. Mouvements vers lint et lext. Migration nucléaire significative.

11 Le VIH utilise le cytosquelette pour se déplacer dans la cellule (3) Mvt dép. et indép. des microtubules Injection de rhodamine-tubuline à des cellules CD4 infectées par HIV (GFP- Vpr,DiD) Microtubules Rouge : VIH-DiD Suivi d1 particule DiD(-) qui utilise le réseau de microtubules Suivi d1 particule DiD(-) qui nutilise pas le réseau de microtubules

12 Le VIH utilise le cytosquelette pour se déplacer dans la cellule (4) Injection dAc anti- dynéine + rhodamine-dextrane (marqueur dinjection=cellules bleues) à des cellules cibles Infection par VIH (GFP-Vpr, DiD) Observation des particules DiD(-) Cellule nayant pas reçu dAc Cellules ayant reçu Ac anti-dynéine : accumulation des particules à la périphérie. Cellules nayant pas reçu lAc : accumulation près du noyau. Ccl : La dynéine permet le mvt des particules vers le noyau. Importance de la dynéine.

13 Identification des complexes de reverse transcription cytoplasmiques (1) Injection Alexa 594- dUTP (rouges) à des cellules CD4 Infection par HIV (GFP-Vpr) Microtubules : Ac anti- tubuline Agrandissement des MTOC MTOC Particules virales ayant incorporé les dUTP Flèches: 2 complexes doublement étiquetés : RTC, associés aux microtubules.

14 Identification des complexes de reverse transcription cytoplasmiques (2) Injection à des cell. CD4/CCR5 dAc anti- dynéine ou IgG contrôle Infection VIH (GFP-Vpr) Diminution de la progression nucléaire 3 fois plus de RTC Masquage des RTC par le signal de fluorescence nucléaire (accumulation près du noyau) Ccl : utilisation de la dynéine par les RTC le long des microtubules.

15 Identification des complexes de reverse transcription cytoplasmiques (3) Injection dAlexa-dUTP (rouge) dans des cellules CD4/CCR5 Infection par VIH (GFP-Vpr) Ac anti-p24 CA Région périnucléaire incorporation de dUTP RTC p24 (-) RTC p24 (+) RTC p24(-) et p24(+) associés aux microtubules

16 67 % des RTC ont 1 quantité de p24 CA similaire aux particules extracellulaires capside intacte pendant linitiation de la RT dans le cytoplasme Particules p24 (+) et (-) asso aux microtubules asso avt la perte de la capside

17 Analyses des RTC au microscope électronique Gelsoline : déplétion de lactine Injection de Alexa-dUTP dans des fibroblastes Infection VIH GFP-Vpr Ac anti-tubuline (bleu) RTC associés aux microtubules EM RTC= cylindre de 100 nm sur 400 Diamètre= 100 nm

18 Discussion 1)Utilisation dune technique de fluorescence pour suivre la progression du VIH dans le cytoplasme Vpr empaqueté dans les virions Fusion GFP-Vpr : détection de ces virions et les complexes dérivés par La sédimentation de GFP-Vpr avec les protéines virales La colocalisation avec p17 MA, p24 CA et les membranes des virions Lassociation de lactivité reverse transcriptase Pour repérer les virus infectieux : particules ayant perdu leur mb marquée (fusion cellulaire) et celles ayant incorporé des desoxynucléotides Mouvement dépendant des microtubules + indépendant (actine?)

19 Discussion 2) Rôle de la dynéine cytoplasmique dans la mobilité du HIV Utilisation du réseau de microtubles par les virions pour arriver au noyau. Association RTC-microtubules non spécifique dune cellule : détection dans les cellules Hos, Hela et fibroblastes. Traitement au nocodazole= destruction du réseau de microtubules=inhibition de linfection par le VIH. Autres études sur HSV et AD-2 = seulement baisse de lefficacité de linfection Entrée proche du noyau? Microtubules résistants au nocodazole? Mvt brownien?

20 Discussion 3) Initiation de la reverse transcription 2 posibilités : Libération de la capside juste après la fusion avec la mb cellulaire. La capside reste intacte jusquà latteinte du pore nucléaire par le génome viral. Etudes structurales de la capside : présence de pores suffisamment larges pour faire rentrer des nucléotides. Association RTC- microtubules avant la perte de la capside.


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