Mécanismes d’action comparatifs et efficacité des biologiques Thierry CARDON et René-Marc FLIPO Lille

Traitement de la polyarthrite rhumatoïde par biomédicaments (1) Un arsenal thérapeutique « riche » De nombreux critères de choix … Liés à la maladie : sévérité clinique, …MEA, … Liés au malade : âge, sexe, …ATCD, … comorbidités, …souhaits, …consentement éclairé, … Liés au traitement : mécanismes d’action, … rapidité d’action, efficacité RX, …, galénique, … sévérité des EI, …modalités de surveillance, … coût, … Liés au médecin : opinion du prescripteur, … école de formation, …FMC, …habitudes prescriptionnelles, … Rituximab Abatacept Infliximab Etanercept Tocilizumab Adalimumab Certolizumab Golimumab

Traitement de la polyarthrite rhumatoïde par biomédicaments (2) Indispensable connaissance « minimale » sur les mécanismes d’action (connus, …) des médicaments biologiques, … Un « effort » de Formation Médicale Continue « inévitable »  Le N° de Décembre 2014 de « Réflexions Rhumatologiques » sur le ciblage des voies de signalisation IL-4, IL-13 IL-6, IL-10 IL-2, IL-7, IL-9, IL-15 IL-3, IL-5, GM-CSF IL-2R IL-3R IL-6R IL-7R IL-13R STAT JAK1 JAK2 JAK3 TYK2 STAT-3 STAT-5 STAT-6 STAT dimers/ oligomers Activation de la transcription Janus kinase TNF-α IL-1 Récepteur TRAF 6 TRAF 2 MEK JNK p38 MP1 Jun, BC12, p53… NFkB, p53, ATF… Noyau Séquence codante Promoteur TNF-α , IL-1 LPS, CD40L LT-α2β2 , LPS, CD40L, BAF IKKƴ IKKβ IKKα NIK p100 p52 p50 p65 p85 Importin ReIB Ixβ-α Ixβ degradation Nucleus R Cytoplasm Voie classique NF-kB Voie alternative NF-kB DNA

Immunologie des vertébrés : défense de l’organisme par le biais de l’interaction immunité innée et adaptative Cellule dendritique Microorganismes des virus Reconnaissance PAMP Macrophage TLR Infection, stress ou transformation Lyse Cytokines Lymphocytes B et T activés Cytokines Chimiokines Tissus Lymphocytes T Réponse adaptative spécifique de l'antigène Réponse innée Ligand NKG2D NKG2D Macrophages, CD, PNN NK CD8+ lymphocytes T CD4+ lymphocytes T La réponse immunitaire a pour fonction la défense de l’organisme contre les agressions. La découverte des toll like récepteurs (TLR) a permis de redéfinir la place et l’importance de l’immunité innée et adaptative dans la régulation de la réponse immunitaire. La réponse innée (macrophages, cellules dendritiques, polynucléaires, cellules NK) intervient en premier en cas d’agression, plus rapide et moins spécifique et jouera un rôle dans la mise en place d’une réponse plus lente, plus spécifique et mieux coordonnée, faisant intervenir les lymphocytes T et B. Cette réaction est modulée par le réseau cytokinique. A terme sera établie une réponse mémoire plus rapide et spécifique. Le dérèglement de ce système immunitaire joue un rôle important dans les pathologies auto-immunes et inflammatoires. PAMP (Pathogen Associated Molecular Patterns) : motifs moléculaires caractéristiques des pathogènes. TLR : Toll-like Receptors. Son dérèglement entraîne l’émergence des pathologies auto-immunes

Immunopathologie de la polyarthrite rhumatoïde Hyperplasie après lésion locale Activation autocrine Infections Membrane synoviale A - Induction B - Inflammation C – Auto-entretien, pérénisation D - Destruction GM-CSF Monocytes circulants potentiellement activés dans la moelle osseuse Infiltration macrophagique Modification des auto-antigènes incluant la citrullination Réseau de cytokines (TNF, IL-6, IL-23) Évènement critique Activation des CPA suivie de l’ activation de l’immunité adaptative Activation de l'immunité innée Immunité adaptative chez les hôtes prédisposés Auto-antigènes du cartilage TEFF TH17 TREG TNF IL-6 IL-17 Macrophage synovial PR Antigènes membranaires Chondrocyte Collagénase Collagène Activation des ostéoclastes induite par les auto-anticorps Autres produits du cartilage Protéoglycanes TH CPA Lymphocyte T Présentation d'auto-antigène (peptides citrullinés) Cellule TREG modifiée Lymphocyte B Activation polyclonale des lymphocytes T et B Production de cytokines inflammatoires Invasion synoviale Formation de centres germinaux et de follicules de lymphocytes-B Environnement génotoxique Protéases, cytokines Formation de pannus Activation des ostéoclastes Os L’immunopathologie de la PR est complexe, elle est caractérisée par une inflammation et une hyperplasie synoviale, une production d’anticorps, une destruction osseuse et cartilagineuse et des manifestations systémiques. Une activation initiale du système immunitaire conduit à une cascade inflammatoire. La présentation antigénique dans un contexte HLA de classe II conduit à une activation polyclonale T et B, insuffisamment contrôlée par les Treg, s’ensuit une destruction ostéo-articulaire stimulée par les cytokines pro-inflammatoires. Burmester GR et al, Nature Reviews Rheumatology 10, 77-88 (2014) Emerging cell and cytokine targets in rheumatoid arthritis

Récepteur de lymphocyte T Inhibiteurs de TNF Infliximab Adalimumab Étanercept Golimumab Certolizumab pegol Anakinra Signalisation IL-1 Signalisation IL-6 Co-stimulation IL-1R IL-6R IL-6 IL-1 Lymphocyte B Lymphocyte T Antigène CMH CPA CD80 ou CD86 Abatacept CD28 Récepteur de lymphocyte T Rituximab CD20 Tocilizumab Déplétion lympho B Autres agents biologiques

Les anti-TNF et le tocilizumab affectent des voies de signalisation intracellulaires cytokininiques différentes Récepteur du TNF Récepteurs d'IL-6 IL-6 JAK1 TYK2 JAK2 NFΚB ERK Signalisation classique Récepteur exprimé par la membrane Trans-signalisation Récepteur soluble de l'IL-6 Réponse classique régulée par les cytokines Prolifération, différentiation, expression génique, survie, mort NFΚB = facteur nucléraire-ΚB ; ERK = kinase régulée par un signal extra-celullaire ; IL-6 = interleukine-6 ; JAK = Janus-activated kinase ; TYK2 = tyrosine kinase 2 Choay EH at al. Nat Rev Rheumatol 2013;9:154-163 Cutolo M. Ther Adv Musculoskel Dis 2013;5:3-11

Les anti-TNF ciblent essentiellement les neutrophiles, les cellules dendritiques et les monocytes/macrophages Anti-TNF Neutrophiles1 CD11c+ cellules dendritiques myéloïdes2 Activation des macrophages et production de NO Production de cytokine par les monocytes Lymphocyte T Lymphocyte B NO = oxyde nitrique

…associés, les anti-TNF en combinaison avec le MTX présentent un mécanisme d’action synergique Anti-TNF + MTX Neutrophiles1 CD11c+ cellules dendritiques myéloïdes2 Activation des macrophages et production de NO Production de cytokine par les monocytes Lymphocytes T régulateurs Lymphocytes T activés et production de cytokines par les lymphocytes T Production d'anticorps par les lymphocytes B (p. ex. FR et ADA) ADA = anticorps anti-médicament FR = facteur rhumatoïde

Le blocage de l'IL-6R par le tocilizumab affecte une série de processus pathologiques Neutrophiles1 CD11c+ cellules dendritiques myéloïdes2 Macrophages2 Lymphocytes T régulateurs5 Lymphocytes Th175 Production de cytokines et de chimiokines par les lymphocytes T6 Lymphocytes B à mémoire, lymphocyte B dans la membrane synoviale3 Lymphocytes B régulateurs4

Abatacept Bloque la costimulation, en empêchant la liaison de CD80/86 avec CD28, inhibe la prolifération et l’activation de tous les sous-types de lymphocytes T, Tregs inclus1 Lymphocyte-T Action précoce au niveau du lien entre immunité innée et adaptative. Abatacept module la réponse immunitaire par liaison au CD80/CD86 sur une cellule présentatrice d'andigène (APC), telle qu'une cellule dendritique, empêchant ainsi la liaison costimulatrice de CD28 sur les lymphocytes T naïfs et l'activation des lymphocytes T atténuateurs 1 Pieper J. et al, CTLA4-Ig(Abatacept) therapy modulates T cell effectors function in auto-antibody positive rheumatoid arthritis patients. BMC Immunol 2013, 14, 34

Lymphocyte-T auxiliaire Rituximab induit une déplétion transitoire lymphocytaire B avec diminution des B mémoires, B auto-réactifs et présentation antigénique B TLR CR Macrophage IL-18 FcR IL-15 IFN-γ IL-2 Lymphocyte T Lymphocyte Th1 IL-12 Lymphocyte-T auxiliaire Co-stimulation IL-6 GM-CSF IFN-α Plasmocyte Plasmocyte à longue durée de vie Plasmocyte à courte durée de vie FR ANCA Anti ADNdb Lymphocyte B naïf Lymphocyte B à mémoire Thérapie anti-CD20 Dans le cadre de l’immunité adaptative les Lc B sont responsables de la production d’anticorps mais jouent aussi un rôle de présentation antigénique, dans la mémoire immunitaire ainsi que l’immunorégulation en lien avec les lymphocytes T. Le rituximab inhibe l’activité B à un stade pré plasmocytaire et permet donc de réduire la réponse et la coopération T-B. Roll P et al, Anti-CD20 therapy in patients with rheumatoid arthritis predictors of response and B cell subset regeneration after repeated treatment Arthritis Rheum 2008; 58, 1566-75

Impact du profil cytokinique sur la présentation phénotypique Foie Vaisseaux sanguins Cerveau Graisse Muscle Acide gras libre adipocytokines Résistance à l'insuline Réponse de phase aiguë (CRP) redistribution du fer (hepcidine) Os Faible densité minérale osseuse Fractures Faible tolérance au stress Dépression Athérogenèse Infarctus du myocarde Attaque cérébrale Particules lipidiques altérées Phénotype HDL pro-inflammatoire Diminution du cholestérol total Faibles augmentations du LDL Complexes immuns complément Interleukine-6 TNF-α TNF-α Interleukine-6 Interleukine-1 TNF-α RANKL Dkk-1 TNF-α Interleukine-1 TNF-α Interleukine-6 Interleukine-6 La présentation phénotypique et l’évolutivité de la maladie sont singulières à chaque patient dépendant du type de voies activées et de leurs profils cytokiniques. Influence du terrain, des gènes de susceptibilité et des facteurs d’environnement. Iain B. McInnes and Georg Schett,,The Pathogenesis of Rheumatoid Arthritis N Engl J Med 2011; 365 : 2205-19.

La réponse clinique dépend de nombreux facteurs Concentration médicamenteuse : Immunogénicité et pharmacocinétique Âge, sexe, tabac, BMI Fonction rénale et hépatique, Association médicamenteuse, Génétique… Activité de la maladie : DAS28, HAQ, Nombre de biothérapies précédentes, Thérapeutiques associées. Physiopathologie : Anti CCP, facteur rhumatoïde, Tabac, cytokines, phénotype des cellules immunitaires… Parmi les différents facteurs susceptibles d’influencer la réponse thérapeutique, certains ont déjà été identifiés, d’autres supposés et à confirmer par des études complémentaires. L’étude des mécanismes d’action peut, dans certains cas, aider à comprendre la réponse clinique. Daïen C et Morel J., Hindawi Publishing Corporation Mediators of Inflammation 2014, Article ID 386148, 11 pages Predictive Factors of Response to Biological Disease Modifying Antirheumatic Drugs: Towards Personalized Medicine

Ainsi l’âge influe sur le système immunitaire, privilégie certaines réponses et donc guide nos orientations thérapeutiques Immunité innée Réduction de la migration des PNN Altérations fonctionnelles PNN, monocytes, CD Diminution cytotoxicité cellules NK Altération du signal des TLR affectant l’efficacité des APC et des molécules de costimulation Augmentation de production des cytokines pro inflammatoires IL-1, IL6, TNF Augmentation taux IL-23 induit activation de la voie TH17 Infiltration macrophagique de la graisse et dysrégulation des adipokines Altération DNA engendre augmentation IL-1, IL-6, IL-8 (Senescence associated secretary phénotype) Augmentation de CRP Infection virale latente chronique (CMV) induit une augmentation TNF et IL-6 Athérosclérose induit une augmentation de production IL-1, IL-6, TNF et CCL2 par VSMC Par exemple, l’un des facteurs susceptibles d’influer sur la réponse thérapeutique et la tolérance est l’âge et sa fragilité induite par des altérations du système immunitaire en particulier inné et la possibilité d’un état inflammatoire chronique. PNN Polynucléaires neutrophiles, CD cellules dendritiques ; NK natural killer, TLR Toll Like Récepteur, APC Cellule présentatrice de l’antigène ; VSMC Vascular Smooth Muscle Cell, Lc Lymphocytes ; TCR récepteur T, Treg Lymphocyte T régulateur

Ainsi l’âge influe sur le système immunitaire, privilégie certaines réponses et donc guide nos orientations thérapeutiques Immunité adaptative Diminution progressive des Lc T naïfs et LcB Augmentation relative des T et B mémoires Diminution de diversité du répertoire du TCR Augmentation ratio CD4/CD8 Augmentation Lc TCD4+CD28- avec augmentation de production de cytokines pro-inflammatoires Modulation des Tregs par la leptine. Par exemple, l’un des facteurs susceptibles d’influer sur la réponse thérapeutique et la tolérance est l’âge et sa fragilité induite par des altérations du système immunitaire en particulier inné et la possibilité d’un état inflammatoire chronique. PNN Polynucléaires neutrophiles, CD cellules dendritiques ; NK natural killer, TLR Toll Like Récepteur, APC Cellule présentatrice de l’antigène ; VSMC Vascular Smooth Muscle Cell, Lc Lymphocytes ; TCR récepteur T, Treg Lymphocyte T régulateur

Connaître le mécanisme d’action permet d’améliorer le choix en cas de manifestations associées et de formes frontières Syndrome de Goujerot-Sjögren Tsuboi H et al Mod Rheumatol. 2014 Sep 11:1-7. Efficacy and safety of abatacept for patients with Sjögren's syndrome associated with rheumatoid arthritis: Rheumatoid Arthritis with Orencia Trial toward Sjögren's syndrome Endocrinopathy (ROSE) trial-an open-label, one-year, prospective study-Interim analysis of 32 patients for 24 weeks. Vascularite Puechal et al, Rituximab Therapy for Systemic Vasculitis Associated With Rheumatoid Arthritis: Results From the AutoImmunity and Rituximab Registry Arthritis Care & Research Vol. 64, No. 3, March 2012, pp 331–339 Amylose Vinicki JP et al J Clin Rheumatol. 2013 Jun;19(4):211-3. Renal amyloidosis secondary to rheumatoid arthritis: remission of proteinuria and renal function improvement with tocilizumab. Atteinte oculaire Artifoni M et al Nat Rev Rheumatol. 2014 Feb;10(2):108-16 Ocular inflammatory diseases associated with rheumatoid arthritis. Atteinte pulmonaire Megna L et al, The safety off biologic therapies in RA-associated interstitial lung disease. Nat Rev Rheumatol. 2014 May;10(5):284-94. Etc……… Connaître les mécanismes d’action des manifestations associées, des formes frontières et des pathologies associées est important pour réduire le risque de complications en cas de mécanismes contradictoires ou pour optimiser la réponse thérapeutique.

La question de l'immunogénicité des biomédicaments (1) Les agents biologiques sont « immunogènes » Les A.D.A. (anti-drug antibodies) « Logique » (molécules étrangères) : immunisation contre la structure primaire, les parties glyquées de la région charnière … et certains épitopes de la région Fab (Ac. anti-idiotypes) Plus fréquente avec les Ac. monoclonaux (Ac. neutralisants) qu’avec les protéines de fusion (étanercept et abatacept / Ac. non neutralisants) D’une fréquence très variable selon les études (techniques de détection …) et les cibles thérapeutiques D’une fréquence plus élevée en cas d’exposition initiale insuffisante (dose et « seuil immunogénique ») … en l’absence de traitement IS associé (MTX) … surtout pour les anti-TNF

La question de l'immunogénicité des biomédicaments (2) Les conséquences associées au développement d’A.D.A. Neutralisation du site actif du biomédicament Augmentation de la clairance (rénale) du biomédicament (formation d’ICC)  Perte d’efficacité Formation d’ICC et risques d’accidents allergiques  Manifestations d’intolérance

La question de l'immunogénicité des biomédicaments (3) Le dosage des taux sériques du biomédicament … Une grande variabilité à l’échelon individuel Démontrée notamment pour les agents anti-TNF Liée au patient lui-même (caractéristiques génétiques : récepteur néonatal …) Liée à la maladie elle-même et son niveau d’activité (mécanismes physiopathogéniques, degré d’inflammation et consommation par les cellules cibles …) Liée aux traitements associés (MTX … CS …)

Alors en pratique : les recommandations EULAR 2013 Recommandation n° 9 « En cas de réponse insuffisante au MTX et/ou autres stratégies reposant sur des csDMARDs, avec ou sans corticoïdes, le recours aux bDMARDs (anti-TNF, abatacept ou tocilizumab, voire rituximab dans certains cas) devrait être envisagé en association au MTX » Après échec aux csDMARDs … Pas de « franche » préférence reconnue … mais importance de l’expérience avec les anti-TNF rappelée … Anakinra : non mentionné (efficacité moindre …) mais éventualité possible à l’échelon individuel … Rituximab : si ATCD récent de lymphome, CI à la prophylaxie anti-TB … Reconnaissance des bsDMARDs (CT-P13) Association au MTX recommandée … mais, en cas de monothérapie, le TCZ « pourrait être » le bDMARD de première intention Smolen J. et al. ARD 2014;73:492-509

PR : les recommandations SFR 2013 MTX-IR Addition de biothérapie Addition de traitement synthétique Efficacité des biothérapies après échec du MTX Proposition de biothérapie : anti-TNF, abatacept ou tocilizumab et dans certaines circonstances rituximab Rituximab ici hors-AMM mais peut être considéré dans certaines circonstances : Si CI aux autres biothérapies notamment Si ATCD personnel de lymphome, tuberculose latente avec impossibilité de chimioprophylaxie ou risque trop important de TB, ATCD personnel de SEP, ATCD personnel de cancer de moins de 5 ans Discussion sur la place du RTX en première thérapie, pour certains pts mais hors AMM. Pb du réglementaire, du coût, sécurité (LEMP). Évènement très grave mais exceptionnel. N Engl J Med. 2013 Jul 25;369(4):307-18. doi: 10.1056/NEJMoa1303006. Epub 2013 Jun 11. Therapies for active rheumatoid arthritis after methotrexate failure. O'Dell JR, Mikuls TR, Taylor TH, Ahluwalia V, Brophy M, Warren SR, Lew RA, Cannella AC, Kunkel G, Phibbs CS, Anis AH, Leatherman S, Keystone E; CSP 551 RACAT Investigators. Collaborators (169) Source Veterans Affairs (VA) Nebraska-Western Iowa Health Care System and University of Nebraska Medical Center, Omaha, NE 68105, USA. james.o'dell@va.gov Abstract CONTEXTE : Peu d'études en aveugle ont comparé la thérapie conventionnelle consistant en une combinaison de médicaments antirhumatismaux de fond (DMARD) avec des agents biologiques chez des patients atteints de polyarthrite rhumatoïde qui avaient une maladie active malgré le traitement avec le méthotrexate-- un scénario courant dans la prise en charge de la polyarthrite rhumatoïde. MÉTHODES : Nous avons mené une étude de non-infériorité en double aveugle pendant 48 semaines dans laquelle nous avons assigné de manière randomisée 353 participants atteints de polyarthrite rhumatoïde qui avaient une maladie active malgré le traitement au méthotrexate à un schéma posologique triple de médicaments antirhumatismaux de fond (méthotrexate, sulfasalazine, et hydroxychloroquine) ou étanercept plus méthotrexate. Les patients qui ne présentaient pas une amélioration à 24 semaines selon un seuil pré-spécifié ont été passés en aveugle à un autre traitement. Le résultat principal était une amélioration du score d'activité de la maladie pour 28 articulations (DAS28, avec des scores allant de 2 à 10 et les scores plus élevés indiquant une plus grande activité de la maladie) à la semaine 48. RÉSULTATS : Les deux groupes présentaient une amélioration significative au cours des 24 premières semaines (P = 0,001 pour la comparaison avec la référence). Un total de 27 % des participants dans chaque groupe a nécessité un changement de traitement à 24 semaines. Les participants des deux groupes qui changeaient de traitement présentaient une amélioration après le changement (P < 0,001), et la réponse après le changement n'était pas significativement différente entre les deux groupes (P = 0,08). La différence entre la référence et 48 semaines dans les DAS28 était similaire dans les deux groupes (-2,1 avec le triple traitement et -2.3 avec l'étanercept et le méthotrexate, P = 0,26) ; le triple traitement était non-inférieur à l'étanercept et au méthotrexate, étant donné que la limite de confiance supérieure à 95 % de 0,41 pour la différence dans la modification du DAS28 était inférieure à la marge de non infériorité de 0,6 (P = 0,002). Il n'y avait pas de différences significatives inter-groupes dans les résultats secondaires, notamment la progression radiographique, la douleur, la qualité de vie liée à la santé ou dans les évènements indésirables majeurs associés aux médicaments. CONCLUSIONS : En ce qui concerne le bénéfice clinique, le triple traitement avec la sulfasalazine et l'hydroxychloroquine ajoutées au méthotrexate, était non-inférieur à l'étanercept plus méthotrexate chez les patients atteints de polyarthrite rhumatoïde qui avaient une maladie active malgré le traitement par le méthotrexate. (Financé par le Programme des études coopératives, Department of Veterans Affairs Office of Research and Development, et autres ; CSP 551 RACAT ClinicalTrials.gov number, NCT00405275.) Gaujoux-Vialat C et al. JBS 2014;81:287-97

Conclusion Une prescription « personnalisée » Antécédents, comorbidités… peur et croyances du patient … Le prescripteur : son expérience … Les résultats discutables des méta-analyses en réseau … Les trop rares études « face-face » … En pratique : de nombreux facteurs impliqués dans le choix du biologique

Back-up

Tocilizumab inhibe les deux types de signalisation de l’IL-6 : récepteurs solubles et membranaires de l’IL-6 gp130 Tocilizumab se lie aux mIL-6R et sIL-6R Signalisation par récepteur membranaire Signalisation par récepteur soluble mIL-6R sIL-6R Tocilizumab To summarize the sequence of events in classical IL-6/IL-6R signal transduction1,2 : IL-6 binds mIL-6R, The IL-6/mIL-6R complex engages gp130, Association of the IL-6/mIL-6R complex with gp130 facilitates interaction between the gp130 molecules; the gp130 molecules “bow” to each other, The resulting close proximity of the gp130 intracellular domains initiates signal transduction and, subsequently, IL-6-mediated gene expression, The sequence of events is the same for IL-6/IL-6R trans-signaling, but the soluble IL-6R (sIL-6R) replaces mIL-6R in the signaling complex1,2. 1. Jones SA, et al. J Interferon Cytokine Res. 2005;25:241-253. 2. Scheller J, Rose-John S. Med Microbiol Immunol. 2006;195(4):173-183. Adapté de: Jones SA, et al. J Interferon Cytokine Res. 2005;25:241-253. Scheller J, Rose-John S. Med Microbiol Immunol. 2006;195(4):173-183. Mihara M. Int Immunopharmacol. 2005 Nov;5(12):1731-40.

Des facteurs prédictifs de réponse sont connus pour certaines molécules L’action privilégiée du rituximab dans les PR séropositives s’explique par son action sur le lymphocyte B.

L’influence du taux de CRP sur la réponse au tocilizumab se comprend bien en connaissant le mécanisme d’action de l’IL-6. L’âge et les facteurs de risque cardio-vasculaires pourraient aussi avoir un impact.

PR : les recommandations SFR 2013 Chez les patients insuffisamment répondeurs ou intolérants au méthotrexate, et : En présence de facteurs de mauvais pronostic, l’addition d’une biothérapie peut être proposée (anti-TNF, abatacept ou tocilizumab et dans certaines circonstances rituximab*) *Si CI aux autres biothérapies notamment En l’absence de facteurs de mauvais pronostic, une combinaison de traitements de fond synthétiques (méthotrexate/sulfasalazine/ hydroxychloroquine) ou bien une rotation pour un autre traitement de fond de synthèse (léflunomide, sulfasalazine) peuvent être proposées. En cas d’échec (ou de contre-indication), une biothérapie doit être envisagée Gaujoux-Vialat C et al. JBS 2014;81:287-97