APPORT DE LA CYTOMETRIE A FLUX DANS LE DIAGNOSTIC ET Les 4èmes Journées Maghrébines d’Hématologie Les 9èmes Journées Nationales d’Hématologie 26,27 et 28 Avril 2007 APPORT DE LA CYTOMETRIE A FLUX DANS LE DIAGNOSTIC ET LA CLASSIFICATION DES THROMBASTHENIES DE GLANZMANN H.ELLEUCH, S.MSEDDI, I.BEN AMOR, H. REKIK, T.SUISSI, J.GARGOURI Centre Régional de Transfusion Sanguine de Sfax Service d’Hématologie CHU. H. Chaker – Sfax

INTRODUCTION (1) TG : Anomalie Felle Déficit quantitatif ou qualitatif des GP IIbIIIa (intégrines αIIbβ3) Autosomale récessive Cause de saignement clinique

INTRODUCTION (2) Exploration biologique : TS/TO Num. Plaq. MO Fonctions plaquettaires SDS PAGE (classification) BM Phénotype membranaire (CMF)

INTRODUCTION (3) Etude par CMF: Méthode simple et précise Les données recueillies: Le % des cellules qui expriment l’Ag L’intensité moyenne de fluorescence (IMF) IMF est proportionnelle à la quantité de sites antigéniques à la surface des plaquettes

Représentation schématique d’une plaquette 1-GP IV: thrombospondine et collagène 2-GP IIbIIIa: fibrinogène et vWF 3-microtubules 4-lysosome 5-GP IaIIa: collagène 6-recepteur de thrombine 7-glycogène 8-système canaliculaire 9-granule α 10-GP IbIXV: vWF 11-granule dense 12-GP IcIIa

Complexe GPIIbIIIa: intégrine αIIbβ3

MATERIELS *Groupe témoin : 10 donneurs de sang 5 F / 5 H Sans ATCD de troubles de l’hémostase Age moyen : 36,4 ans (25-51 ans) Taux moyen de plaquettes : 294,2 103/µl * 13 patients: 5 F / 8 H Classés type I ou II par l’étude de la rétraction du caillot et/ou le SDS PAGE

Caractéristiques des patients Fonctions plaquettaires N/P Sexe Age actuel Age et symptômes au Dg Type de Sd Hgique Bilan hémostase Fonctions plaquettaires Classifi-cation T.N H 8 1 an, gingivorragies gingivorragies, circoncision préparée Plq: 270.103/µl TS: 2’30’’/ V= 45µl TP:86%, TCA:31/30 Ag. nulle à l’ADP RC: nul I RC J.N F 29 3ans, épistaxis, gingivorragies hématurie, ménométrorragies, gingivorragies Plq:246.103/µl TS: 4’30’’/ V: NP TP:80%, TCA: 32/32 Ag. Nle au Risto Ag. nulle à l’ADP et Adrénaline RC: bonne II L.N 27 2 ans, épistaxis, gingivorragies, hgie. digest. épistaxis, gingivorragies, ménorragies Plq:250.103/µl TS: 9’ / V: NP TP:100%,TCA: 30/30 SDS PAGE K.I 16 9 ans, épistaxis, gingivorragies gingivorragies, ménorragies, Hématome de l’épaule Plq:347.103/µl TS: 2’30’’/ V=38µl TP:96%,TCA: 27/30 Z.T 21 14 ans, épistaxis, gingivorragies épistaxis, gingivorragies, circoncision sans préparation Plq:254.103/µl TS: 4’/ V: NP TP:74%,TCA: 30/30 CMF Z.K 4 ans, circoncision hémorragique épistaxis + , gingivorragies + Plq:240.103/µl TS: NF TP:98%, TCA: 29/30 RC: NF

B.R H 23 2 ans, épistaxis, gingivorragies, circoncision hémorragique épistaxis, hgie. digest. otorragie Plq: 450.103/µl TS: 5’30’’/ V: NP TP:100%, TCA:30/35 Ag. Nle au Risto Ag. nulle à l’ADP RC: bonne II RC N.H F 7 3ans, épistaxis épistaxis, gingivorragies, Plq:214.103/µl TS: 3’/ V: NP TP:100%,TCA: 23/26 Ag. Nle au Risto Ag. nulle à l’ADP I CMF I.RI 18 3 ans, épistaxis, circoncision hémorragique épistaxis, gingivorragies, hgie. digest. Plq:220.103/µl TS: 5’30’’(Duke) TP:100%,TCA: 30/30 Ag. nulle à l’ADP et Adrénaline RC: nulle I.RA 12 5 ans, épistaxis, épistaxis, gingivorragies Plq:297.103/µl TS: 2’/ V=13µl TP:65%,TCA: 30/32 Ag. nulle à l’ADP RC: nulle G.S 16 13 ans, épistaxis, gingivorragies Plq:230.103/µl TS: 2’30’’/ V: 16µl TP:50%,TCA: 29/30 M.W 24 8 mois épistaxis Plq:176.103/µl TS: 7’ (Duke) TP:80%,TCA: 30/30 Ag. nulle à l’ADP RC: bonne SDS PAGE M.A 3 mois, épistaxis, gingivorragies, circoncision hémorragique épistaxis Plq:150.103/µl TS: 10’/ V: NP TP:80%,TCA: 30/30

METHODES (1) Pour ces 2 groupes : Prélèvements : 2 tubes sur citrate de sodium 1 tube sur EDTA Agrégation plaquettaire : Chrono-Log 500VS Méthode optique Sur PRP ADP : 20µM Collagène : 5µg Acide arachidonique (AA) : 2mM Ristocétine : 1,25 µg

METHODES (2) CMF : Coulter EPICS XL CD41a-PE clone HIP8: GPIIb (αIIb integrin) BD. Bioscience CD61-PE clone SZ21: GPIIIa (β3 integrin) Immunotech CD42b-FITC clone HIP1: GPIb BD. Bioscience Mouse IgG1-FITC et IgG1PE BD. Bioscience Pour chaque échantillon : IgG1-FITC/IgG1-PE CD42b-FITC/CD41a-PE CD42b-FITC/CD61-PE

METHODES (3) Sang avec EDTA PRP + GR Culot plaquettaire + PPP 2 lavages PBS + EDTA à 0,33% Resuspension dans le PBS à une cc de 105/µl 50µl de plaquettes + 10 µl Ac Incubation 30 mn à l’obscurité 200 µl de solution de lyse (10 mn) lavage PBS Resuspension PBS Lecture

RESULTATS (1) Agrégation plaquettaire Agents inducteurs Hauteur Groupe Témoin : Agents inducteurs ADP 20µM Collagène 5µg AA 2mM Ristocétine 1,25µg Hauteur maximale :ΔTL Moyenne 91,38 92,38 94,13 Agglutination + Écart-type 11,35 10,04 7,63 - p<0,01 Patients : Agents inducteurs ADP 20µM Collagène 5µg AA 2mM Ristocétine 1,25µg Hauteur maximale :ΔTL Moyenne Abce 24,95 49,32 Agglutination + Écart-type - 8,27 9,91

RESULTATS (2) Étude en CMF % des cellules Ag+ : patients classés Type I N/P CD41a (% d’expression) CD61 (% d’expression) T.N H 0 % (Absence) 98 % L.N F 33 % 63 % N.H I.RI 55 % 10 % I.RA 58 % 14 %

RESULTATS (3) Étude en CMF Ac anti-GP Groupe Témoin : Ac anti-GP CD42b CD41a CD61 Intensité moyenne de fluorescence IMF Moyenne 31,20 9,78 242,86 Écart-type 3,24 1,09 77,18 P=0,56 p<0,01 p<0,01 Patients : Ac anti-GP CD42b CD41a CD61 Intensité moyenne de fluorescence IMF Moyenne 29,23 3,66 10,75 Écart-type 11,39 2,05 11,45

Intensité moyenne de fluorescence IMF IMF (% par rapport à la normale) RESULTATS (4) Étude en CMF Patients : Ac anti-GP CD42b CD41a CD61 Intensité moyenne de fluorescence IMF Type I 35,22 1,82 1,79 Type II 25,49 4,80 16,35 IMF (% par rapport à la normale) 112.88 18,63 0,74 81.69 49,13 6,71 P=0,14 p<0,01

Contrôle

TG type I IMF: 2,41 IMF: 38,3

TG type I IMF: 1,28 IMF: 43

TG type I

TG type II IMF: 4,49 IMF: 28,4

TG type II IMF: 37,2 IMF: 31,7

TG type II

COMMENTAIRES (1) Pour le type I Pour le type II CD41a: 18,63% de la normale CD61: 0,74 % de la normale Surexpression de la GPIb:112,88% Pour le type II CD41a:49,13% de la normale CD61: 6,71 % de la normale expression de la GPIb:81,69%

COMMENTAIRES (2) Peu d’études sont réalisées dans ce sens: Etude indienne: Am.J.Hematol. 2003 : 10 Patients: CD41 et CD61 6 Type I: absence de GP IIb IIIa 3 Type II: GP IIb IIIa de 7,72 à 20,40 % de la normale 1 Variant: GP IIb IIIa de 46 %, RC: 60 %

COMMENTAIRES (3) La détermination de l’IMF quantifier le nombre de molécules à la surface des cellules Il y’a des trousses permettant de quantifier les GP: nombre de sites antigéniques utilisation d’une gamme de calibration (4 suspensions de billes de calibration correspondant chacune à un taux connu de sites antigéniques) Conversion de l’IMF en nombre d’Ac fixés par cellule

CONCLUSION (1) Proposition d’une classification pour la TG: Type I IMF (CD41a): 0 à 20 % de la normale et/ou IMF (CD61): 0 à 2 % de la normale Type II ou variants: IMF (CD41a) > 20 % de la normale et IMF (CD61) > 2 % de la normale

CONCLUSION (2) Notre étude doit être complétée Confirmation de nos résultats sur un effectif beaucoup plus important Etude par CMF de la capacité des plaquettes activées à lier le fibrinogène (Variants)