totipotentes Stade 8 cellules ovocyte fécondé blastocyste cellules souches embryonnaires (ES) auto-renouvellement oct-4, nanog, sox-2 activité télomérase élevée pluripotence Endoderme Pancréas Thyroïde Poumon Intestin Hépatocytes Mésoderme Cardiomyocytes Chondrocytes Adipocytes Lymphocytes, GR Muscle Macrophages Endothéliales Ectoderme Kératinocytes Neurones Crête neurales (mélanocytes, …) Germinales Ovocytes Spermatogonies

Pluripotence des cellules couches embryonnaires (I) Cellules ES (+ LIF) - LIF Gouttes pendantes Jours de culture et de différenciation Adhésion et croissance des corps 20 Culture en suspension (boites de Pétri) Ectoderme (feuillet externe) Mésoderme (feuillet médian) Endoderme (feuillet interne) Cellules épidermiques Cellules neuronales Cellules cardiaques Cellules musculaires Globules rouges… Cellules pancréatiques Cellules thyroïdiennes Cellules pulmonaires

Femelle porteuse souris chimérique Pluripotence des cellules couches embryonnaires (II) Cellules ES Recombinaison homologue Cellules ES dont un gène est modifié Injection dans le blastocyste

Pluripotence des cellules couches embryonnaires (III) Tératome: Tumeur bénigne ou maligne formée à partir de tissus multiples étrangers à la région qui l'entoure Bone Gut kidney neuroectoderm ES

muscles Neurones cardiomyocytes kératinocytes macrophages cellules endoth é liales adipocytes chondrocytes spermatogonies hépatocytes îlots de Langherans mélanocytes ovocytes globules rouges lymphocytes cellules de la r é tine cellules gliales

Sciences 1998 Thérapie cellulaire Médecine régénératrice Sang leucémie anémie Cerveau parkinson alzheimer huntington Moëlle épinière Cœur infarctus path. cardiaques muscle dystrophie musculaire Peau brûlures Foie cirhose hépatite pancréas diabète Os/cartilage arthrite ostéoporose blessures Potentiel thérapeutique des cellules ES

Applications of ES-based cell therapy - ES-derived cardiomyocytes into infarcted rat heart (Klug et al JCI 98,216) - ES-glial precursors into myelin-def. rats (Brüstle et al Science 285,754) - hES-derived neuronal into motoneuron-injured rats (Donovan et al Nature 414,92) - ES-derived pancreatic beta cells into diabetic mice (Hory et al PNAS 99,16105) - ES-derived neuronal into Parkinson mice (Kim et al Nature 418,50) - Undifferented ES cells into infarcted rat heart (Behfar et al FASEB J. 16,1558)

Prévalence: ~ patients en France Pathologie: Perte des neurones dopaminergiques de la substance noire (pars compacta) Symptômes: Tremblements, Rigidité musculaire, Ralentissement des gestes (akinésie, bradykinésie) Instabilité posturale La maladie de Parkinson

Dopamine neurons derived from embryonic stem cells function in an animal model of Parkinson's disease J KIM*, J M. AUERBACH*†, J A. RODRÍGUEZ-GÓMEZ, I VELASCO, D GAVIN, N LUMELSKY, S LEE†, J NGUYEN†, R SÁNCHEZ-PERNAUTE†, K BANKIEWICZ† & R MCKAY NIH, Bethesda. Nature 418, (2002) Modèle animal de la maladie de Parkinson: Administration de 6-OH-DA dans le striatum détruit les neurones dopaminergiques. Commutateur de différenciation: promoteur nurr-1 + SHH + FGF8: - Isolement de neurones DOPA (78%) - Injection des cellules dans le striatum. On retrouve les corps de cellules ES TH + dans la région de la greffe (a-c) mais des prolongements dans le parenchyme du striatum hôte jusqu’à 2 mm de la greffe (d-g). Marquage anti-Tyrosine Hydroxylase (TH).

800 rotations/70 min 1 rotation/5 sec Administration d’amphétamine aux animaux lésés par le 6-OH-DA induit une rotation autour du site d’injection.

By demonstrating efficacy while avoiding tumour formation, Kim et al. have achieved a proof of principle, although ES cells that have been genetically modified in this way might not be desirable for use in people. 800 rotations/70 min 1 rotation/5 sec Administration d’amphétamine aux animaux lésés par le 6-OH-DA induit une rotation autour du site d’injection.

Dépend des passages en culture

Embryos lacking the Id1, Id2, and Id3 genes display multiple cardiac abnormalities and die around E13.5. Discontinous Endocardial cell lining Reduced myocardial proliferation

B. Injection of a small number of wild-type ES cells carrying a lacZ marker into Id mutant blastocysts resulted in about 20% chimerism of heart tissue and complete rescue of the Id mutant phenotype. Injection de cellules ES Niches de ES Short-range signals C. Wnt5a, a locally secreted factor, and IGF-1, a bloodstream factor that promotes myocyte proliferation--were identified as potential candidates involved in the rescue process. Injection de IGF-1 ou cellules ES Long-range signals

Modèle cellulaire - mise au point de médicaments - tests pharmacologiques - tests toxicologiques - développement embryonnaire Thérapie cellulaire Médecine régénératrice Sciences 1998

Transcriptome miRNAs Functional genomics (siRNAs) ES cells Epidermal cells (K5/K14) Ectodermal cells (K8/K18) BMP-4 ∆Np63 Neural cells Characterize the genes and signalling pathways involved in epithelial fate Characterize the defective development process due to mutant p63 isoforms

but limitations : - heterogeneous population - teratoma - uncontrolled cell growth - allograft (tolerance?) - ethical issues fertilized oocyte totipotency 8-stage cells blastocyst embryonic stem cells Cell therapy - drug design - toxicological tests - embryonic development Cellular model:

murine ES cells Reconstituted skin from murine ES cells Coraux et al. (2003) Current Biology Aberdam et al. (2005) Int J Dev Biol. skin from ES cells mouse embryonic E18.5 skin epidermis dermis ECM + BMP-4 Ectoderm dermal fibroblasts epidermal cells (K5/K14) Mesoderm K10/nidogen filaggrin collagen VII

MEF + IT media 95.5% 4.7% H9 I3 I6 IT1 on type I collagen 63.3% K18 K % Ctrl IT1 ectodermal cell population from human ES cell lines ECM + BMP-4 K8/K18

K14p63lama3 H9 IT1 M - oct-4K5K18 Hela IT1 - HaCaT IT1 M HaCaT IT1 - HaCaT IT1 - HaCaT IT1 - M G1 36.3% G2-M 33.2% S 30.5%. G1 63.3% G2-M 11.2% S 25.5%. huES IT1 G1 66.7% G2-M 11.1% S 22.2%. Hela G1 G2 M ES S somatiques S G2 M G1 S checkpoint

H9IT XX IT1 ectodermal cell population derived from huES are somatic-like cells IT1 reaches senescence after 60 doubling population (around passage 15) SA-  gal at pH 6.0

ectodermal cells Human embryonic stem cells Does IT1 ectodermal cell population display multipotency ? IT1 teeth mammary gland trachea oesophagus endoderm-derived epithelia keratinocytes corneal cells hair follicle sebocytes

IT1 differentiation K18/K days HacaT ECM K5/K14- positive cells sebocyte- like cells « adipogenic cocktail » MC5R, MC1R GPDH K7 K20?

p63 c-myc K14 merge IT1-control IT1-  Np63 IT1 infected with a lentiV-  Np63 produce epidermal-like cells BMP-7

Pax6 pax-6/K12 dapi/K12 IT1-Pax-6 IT1-p63 Real time RT-PCR IT1 infected with a lentiV-Pax-6 produce corneal-like cells