Année 2008 Équipe pédagogique du lycée Jean MOULIN (ANGERS) DURAND – POCHET 1 Dénombrement ou numération manuelle des cellules sanguines Dilution Mise en hématimètre Comptage

Année Équipe pédagogique du lycée Jean MOULIN (ANGERS) DURAND - POCHET Dilution Indispensable pour dénombrer un nombre raisonnable de cellules Adaptée au type cellulaire étudié pour Le taux de dilution Le diluant

Année Équipe pédagogique du lycée Jean MOULIN (ANGERS) DURAND - POCHET Dilution par dispositif Unopette® Matériel : dispositif type Unopette  disponible uniquement pour numération des plaquettes et leucocytes Volume : 1980 µL Propriétés du liquide : hypotonique hémolysant les hématies contenant un antiagrégant plaquettaire Volume : 20 µL Permettant une dilution au 1/100 ième pour dénombrer les thrombocytes et éventuellement les leucocytes Capillaire mesurant précisément le volume de sang Réservoir scellé contenant un volume précis et adapté de diluant

Année Équipe pédagogique du lycée Jean MOULIN (ANGERS) DURAND - POCHET Dilution Technique 1. Percer l’orifice du réservoir à l’aide du capuchon rigide 2. Homogénéiser le sang en agitant le tube 3. Plonger le capillaire dans le sang et laisser monter le sang par capillarité 4. Sortir le capillaire et essuyer l’extérieur 5. Presser sur le réservoir pour créer une dépression 6. Introduire le capillaire jusqu’à la garde 7. Relâcher la pression ce qui aspire le sang 8. Rincer le capillaire en pressant et relâchant modérément sur le réservoir 9. Homogénéiser la suspension 10. Retourner le capillaire en prenant garde aux aérosols 11. Positionner le capuchon rigide.

Année Équipe pédagogique du lycée Jean MOULIN (ANGERS) DURAND - POCHET Mise en hématimètre Nécessaire pour dénombrer dans un volume connu le nombre de cellules présentes dans une certaine fraction de la suspension préparée.

Année Équipe pédagogique du lycée Jean MOULIN (ANGERS) DURAND - POCHET Mise en hématimètre Matériel Hématimètre adapté propre et sec possédant deux plateaux parallèles deux rigoles un plancher où est gravé un quadrillage Lamelle épaisse planée optiquement collée sur les plateaux délimitant ainsi la profondeur De face De profil Plateaux Rigoles Plancher

Année Équipe pédagogique du lycée Jean MOULIN (ANGERS) DURAND - POCHET Hématimètre de Malassez Surface totale quadrillée de 5 mm 2 : (2,5 x 2) mm Constituée de 100 rectangles 25 quadrillés en 20 petits carrés 25 non quadrillés 25 possédant des lignes horizontales 25 avec des lignes verticales Profondeur de 0,2 mm définie par la lamelle planée Soit Volume total : 1 µL Volume d’un rectangle : 1/100 µL Volume d’une bande de dix rectangles : 1/10 µL

Année Équipe pédagogique du lycée Jean MOULIN (ANGERS) DURAND - POCHET Mise en hématimètre Technique 1. Placer l’hématimètre propre, sec et muni de sa lamelle sur une surface horizontale 2. Homogénéiser la suspension cellulaire 3. Éliminer les premières gouttes non homogènes 4. Placer le capillaire au niveau du vide sous la lamelle 5. Presser sur le réservoir pour introduire dans la cellule de comptage en une seule fois, rapidement, sans bulles d’air, sans déborder dans les rigoles

Année Équipe pédagogique du lycée Jean MOULIN (ANGERS) DURAND - POCHET Hématimètre de Malassez Numération des érythocytes (hématies) Dilution (D) : 1/200 Volume (V) : 4 rectangles quadrillés les plus éloignés possibles soit 4/100 µL = 1/25 µL = 0,04 µL Nombre d’hématies par litre de sang = Somme des nombres trouvés dans les 4 rectangles x 1/V x 1/D Somme des nombres trouvés dans les 4 rectangles x 25 x 10 6 x 200

Année Équipe pédagogique du lycée Jean MOULIN (ANGERS) DURAND - POCHET Numération des érythrocytes Comptage Dénombrement dans le volume Dénombrement en zone limite (1/2) Total : 223 globules rouges dans ce rectangle puis 218, 215 et 219 dans les autres rectangles

Année Équipe pédagogique du lycée Jean MOULIN (ANGERS) DURAND - POCHET Numération des érythrocytes Résultats Homogénéité entre zones comptées 5 % de la valeur moyenne (219) = 10 Écart toléré : 219 ± 10 soit de 209 à 229 Toutes les valeurs sont comprises dans cet intervalle : la numération est homogène et le nombre de 875 contenu dans un volume de 0,04 µL de dilution au 1/200 peut être pris en compte. Si une nouvelle numération sur une autre mise en hématimètre validée comme homogène donne une valeur de 861 : Concordance des valeurs trouvées Les deux valeurs sont concordantes ; la moyenne peut être faite : ( )/2 = 868 Le résultat de la numération des hématies de ce sang est calculé : 868 x 25 x 10 6 x 200 = 4, = 4, /litre de sang pur

Année Équipe pédagogique du lycée Jean MOULIN (ANGERS) DURAND - POCHET Numération des érythrocytes Interprétation Valeurs de référence 4 à 5 T(10 12 ) /L sang 4,5 à 5,5 T(10 12 ) /L sang Résultat inférieur aux valeurs de référence  Érythropénie pouvant entraîner une anémie si le taux d’hémoglobine est également abaissé Résultat supérieur aux valeurs de référence  Polyglobulie probable (à confirmer par un hématocrite et un dosage d’hémoglobine élevés)

Année Équipe pédagogique du lycée Jean MOULIN (ANGERS) DURAND - POCHET Hématimètre de Malassez Numération des leucocytes Dilution (D) : 1/20 Volume (V) : Tout le volume soit 1 µL Nombre de leucocytes par litre de sang = Nombre trouvé dans le quadrillage x 1/V x 1/D Nombre trouvé dans le quadrillage x 10 6 x 20

Année Équipe pédagogique du lycée Jean MOULIN (ANGERS) DURAND - POCHET Numération des leucocytes Comptage Dénombrement dans le volume total : les 100 rectangles Dénombrement en zone limite (1/2) : le pourtour du quadrillage * * * * * * X 100 X 400 Ici : 22 globules blancs dans ces 4 rectangles (attention aux artéfacts*) Dans les 100 rectangles, le nombre trouvé est de 290

Année Équipe pédagogique du lycée Jean MOULIN (ANGERS) DURAND - POCHET Numération des leucocytes Résultats Concordance des valeurs trouvées Deux dénombrements sur deux mises en hématimètre différentes donnent les valeurs suivantes : 290 et 310 Elles sont concordantes ; la moyenne peut être faite : ( )/2 = 301 Le résultat de la numération des leucocytes de ce sang est calculé : 300 x 10 6 x 20 = 6, = /litre de sang pur

Année Équipe pédagogique du lycée Jean MOULIN (ANGERS) DURAND - POCHET Numération des leucocytes Interprétation Valeurs de référence 4 à 10 G (10 9 ) /L sang Résultat inférieur aux valeurs de référence  Leucopénie due à la baisse d’une variété leucocytaire (à rechercher par l’établissement de la formule leucocytaire) ou à une baisse globale Résultat supérieur aux valeurs de référence  Hyperleucocytose due à l’augmentation d’une variété leucocytaire ou à une augmentation générale

Année Équipe pédagogique du lycée Jean MOULIN (ANGERS) DURAND - POCHET Hématimètre de Malassez Numération des thrombocytes (plaquettes) Dilution (D) : 20 µL / 2000 µL = 1/100 Volume (V) : 2 bandes de dix rectangles Soit 20 x 1/100 µL = 1/5 µL = 0,2µL Nombre de thrombocytes par litre de sang = Somme du nombre trouvé dans les deux bandes x 1/V x 1/D Nombre trouvé dans les deux bandes x 5 x 10 6 x 100

Année Équipe pédagogique du lycée Jean MOULIN (ANGERS) DURAND - POCHET Numération des thrombocytes Comptage Dénombrement dans 20 rectangles (2 bandes de 10) Dénombrement en zone limite (1/2) : le pourtour des deux bandes Ici : 12 plaquettes dans ce champ Dans les 20 rectangles, le nombre trouvé est de 540 X 400

Année Équipe pédagogique du lycée Jean MOULIN (ANGERS) DURAND - POCHET Numération des thrombocytes Comptage Délicat à cause des propriétés des plaquettes : Adhésives -> utiliser d’un anticoagulant et d’un liquide antiagrégant Réfringentes -> éliminer tout source d’erreur (poussières et microbulles d’air) par nettoyage et séchage minutieux Petites et légères -> réaliser une sédimentation longue (40 minutes pour l’hématimètre de Malassez) en chambre humide. Résultats obtenus lors de deux mises en hématimètre différentes : 540 et 562 Elles sont concordantes ; la moyenne peut être faite : ( )/2 = 551 Le résultat de la numération des thrombocytes de ce sang est calculé : 551 x 5 x 10 6 x 100 = /litre de sang pur

Année Équipe pédagogique du lycée Jean MOULIN (ANGERS) DURAND - POCHET Numération des thrombocytes Interprétation Valeurs de référence 200 à 400 G (10 9 ) /L sang Résultat < 150 G/L  Thrombopénie Résultat > 500 G/L  Thrombocytose