Les méthodes génétiques de l’amélioration des plantes Georges Pelletier INRA Station de Génétique et d ’Amélioration des Plantes Route de St-Cyr 78026 Versailles Cedex, France Blois le 09 05 2007

Parler de « produits naturels » est donc un abus de langage Il n’existe pas d’espèce cultivée qui n’ait été modifiée par l’homme depuis sa domestication, la perpétuelle sélection de caractéristiques nouvelles et plus récemment, la réalisation de combinaisons inédites entre des variants génétiques, spontanés ou provoqués. Parler de « produits naturels » est donc un abus de langage

Alors que pendant des millénaires la transformation des plantes sauvages en plantes cultivées s’est réalisée par la lente sélection des mutations spontanées, l’amélioration raisonnée des variétés végétales a commencé il y a 2 siècles environ, mettant en œuvre des méthodes et des techniques de plus en plus sophistiquées, qui s’appuient sur les découvertes successives de la biologie et qui contrastent avec l’apparente banalité et familiarité de ces espèces.

Redécouverte des lois de De l’empirisme à la rationalisation de l’amélioration des plantes cultivées 1ers hybrideurs Débuts de la sélection raisonnée Domestication MUTATION -10 000 1700 1800 1900 RECOMBINAISON Sexualité des végétaux Redécouverte des lois de Mendel Hybridations interspécifiques Linné Les chromosomes support de l’hérédité

Le téosinte est l’ancêtre (-7000) du maïs (Beadle 1932, Doebley 2005) Zea mays Hybride F1 Zea mays ss parviglumis Téosinte et maïs primitif

Yam Kaax, le Dieu Maya du maïs

Temple de Xunantunich à Belize

Au nord de la Syrie on trouve des étendues importantes de blé sauvage, en l’absence de toute autre espèce végétale, une herbe dont les grains se détachent de l’épi et tombent sur le sol dès maturité et donc qui se reproduit spontanément. Il s’agit là d’une relique d’un peuplement végétal qui s’étendait au néolithique sur de vastes territoires, quand l’homme du Proche-Orient, encore chasseur-cueilleur, allait progressivement devenir agriculteur. La caractéristique principale de la domestication de cette espèce, sera la résistance à l’égrenage spontané (1000 ans environ!) puis…

L’évolution et la domestication des blés par hybridation spontanée entre espèces Génome A T. urartu 1B 2B 3B 4B 5B 6B 7B 1A 2A 3A 4A 5A 6A 7A 1D 2D 4D 5D 6D 7D Blé dur Génome B Ae. section Sitopsis Blé tendre Génome D Ae. tauschii

Carl von Linné :1707- 1778 - Il considère d ’abord que les espèces vivantes sont des « idées de Dieu » et qu’il n’y a plus de création possible d’autres espèces (Créationnisme). - Il adopte les idées sur la sexualité des plantes et fait des caractères floraux la base de leur classification. - Observe des mutants spontanés (chez la linaire) sans renoncer tout à fait au Fixisme... Réalise une centaine d’hybridation entre espèces, (1717 premier hybride chez les oeillets par Fairchild) et considère qu’il y a là un moyen de les améliorer en produisant de nouvelles formes… Le XVIIIème siècle va voir se multiplier les hybridations entre espèces en particulier pour l’horticulture. L’exploitation rationnelle ne viendra qu’au XXème

Exploitation de croisements interspécifiques ou intergénériques Espèces créées par croisements interspécifiques spontanés - Création d’espèces : blé, cotonnier, colza, moutarde brune, fraisier, tabac, peuplier, pêcher-amandier,… Des flux de génomes ont été à la base de la création d’espèces essentielles pour l’Humanité. Croisements interspécifiques provoqués Recours aux techniques de culture d’embryons, d’analyse des caryotypes, de polyploïdisation… Ray-grass hybride L. perenne x L.multiflorum 1978, AUGUSTA Porte-greffes V. vinifera x V. berlandieri 1978, FERCAL (vigne) Arabusta C. arabica x C. canephora 1980, ARABUSTA Triticale Blé x Secale cereale 1983, CLERCAL Porte-greffes P. domestica x P. spinosa 1989, AVIVEL TORINDEL (abricotier)

Transfert de gènes par hybridation interspécifique Exemple de la tomate (Lycopersicon esculentum) L. esculentum L. pimpinellifolium* L. cheesmanii* L. parviflorum L. chmielewskii L. chilense L. hirsutum* L. pennellii* L. peruvianum*

L. hirsutum, Photo A. Moretti Transfert de gènes par hybridation interspécifique Exemple des gènes de résistance chez la tomate L. esculentum x L. hirsutum Cladosporium fulvum, Corynebacterium michiganense TMV, PVY L. esculentum x L. peruvianum Fusarium oxysporium radici, Pyrenochaeta lycopersici TMV, TYMC, L. esculentum x L. pimpinellifolium Fusarium oxysporium 0 et 1, Phytophthora infestans, Verticillium dahlia, Pseudomonas solanacearum, P. tomato, # 10 % du génome (3000 gènes) des tomates cultivées proviennent d ’autres espèces. (Même chose pour la pomme de terre) L. hirsutum, Photo A. Moretti

L ’introgression de caractères Exemple du blé Ae. elongatum (résistance à la sécheresse - 'Siao Yen 4'). Ae. intermedium (résistance aux rouilles - 'Weique', 'Sin Su Guan'). Ae. ovata (haute teneur en protéines - 'Encore', 'Frontiers-Man',…). Ae. ovata (résistance au virus de la mosaïque striée du blé (WSMV)). Ae. squarrosa – Gènes Lr21 et Lr22a (résistance à la rouille brune). Ae. ventricosa - Gène Pch1 (résistance au piétin-verse - 'Roazon'). Ae. ventricosa - Introgression Yr17-Lr37 (résistances aux rouilles - 'Roazon'). S. cereale (seigle) - introgression 1B/1R sur laquelle se trouve des gènes d'intérêt tels que : 1) le gène Pm8 (résistance à l'oïdium), 2) le gène Yr9 (rouille jaune) et, 3) le gène Lr26 (rouille brune), S. cereale (seigle) - rouille de la tige, résistance au froid Voir également, piment, laitue, tounesol, chou, colza, etc…

Le polymorphisme et la diversité biologique à l’intérieur de l’espèce 1. Les mutations s’accumulent au cours des générations …ATTGCATAAAATGTTAGGCCCGCCGATATAT… Allèle 1 …ATTGCATAAAATGTTAGGTCCGCCGATATAT… Allèle 2 2. Des éléments de l’ADN (transposons) se déplacent, se multiplient, s’insèrent à l’intérieur des gènes (inactivation), transportent des gènes ou des fragments de gènes d’un endroit à l’autre du génome. 3 Les plantes supportent des « multiplications » de leur génome (polyploïdie), c’est à dire 3, 4, 6, 8, 20 lots de chromosomes et pas seulement 2 (lot maternel + lot paternel). Plus ces différences sont fréquentes dans une population de plantes et plus il y a de biodiversité utilisable pour améliorer l’espèce

La variabilité spontanée et son exploitation Exploitation des mutants spontanés Les mutations spontanées constituent la base de la variabilité génétique exploitée par tous les sélectionneurs 1865, mutation « pois ridé » (Mendel). 1872, première variété de haricot avec des grains restant verdâtres (flageolet). 1930, mutation permettant d’ajouter l’orangé à la palette de couleurs de la rose. 1948, mutation monogerme chez la betterave. 1986, « afila », mutation (sans feuilles) exploitée chez le pois protéagineux.

Création et exploitation de mutants Mutagenèse artificielle - Découverte des radiations ionisantes au début du 20ième siècle. - 1927: Les altérations (mutations) provoquées par les radiations sont héritables. - Diversification des agents mutagènes Physique: Rayons g, Rayons X, Ultraviolets,… Chimique: EMS,... Variations induites par des cultures de cellules in vitro. Exemples Pamplemousse Aspermie 1970 Couleur rouge de la pulpe,1984 Cerisier Autofertilité 1985 Riz Qualité du grain 1970 Forsythia Port compact 1985 Orge à brasserie semi-nanisme (plus de 150 variétés) Tournesol riche en acide oléique 1976 (toutes les variétés riches en acide oléique inscrites en France et aux USA) Colza riche en acide oléique. Colza à teneur réduite en acide linolénique 2252 variétés recensées par la FAO/IAEA en 2000.

(prise de conscience que tout n’est pas héritable!) Pour améliorer la productivité :sélection massale puis sélection généalogique Choix des meilleurs porte-graines sur leurs performances propres: Amélioration des populations de plantes autogames mais échec en ce qui concerne les plantes allogames Milieu du 19ième siècle UNE REVOLUTION : LA SELECTION GENEALOGIQUE L’appréciation des différentes plantes est basée sur les performances de leurs descendances (prise de conscience que tout n’est pas héritable!) Amélioration des populations d’espèces autogames (blé, orge,…) ou allogames (betteraves) En opposition avec l’idée que le milieu est le facteur essentiel de la variation héréditaire entre individus de la même espèce.

Evolution de la productivité du blé depuis 2000 ans x50 Un grain de blé x3 1er siècle x6 1800 Progrès dans les méthodes culturales au moyen-âge d ’où augmentation de la production par 6

Exemples de résultats de la sélection: Betterave Monogermie + faculté germinative : Economie de main d ’œuvre (40% du C.A.) + Economie de semences (1kg/ha au lieu de 20 kg) Amélioration des techniques culturales et amélioration génétique : De 70 g de sucre extrait au m2 en 1810 à 1,1 kg en 1990 Colza (acides gras) 1970 actuelle (Supérieure au plan diététique) Saturés 5% 8% Oléique 20% 61% Linoléique 15% 21% Linolénique 10% 10% Erucique 50% 0% Progression du rendement / ha de 100% en 20 ans

Polyploïdisation La polyploïdisation est la multiplication du nombre de chromosomes. Elle se produit de manière spontanée chez les plantes du fait de la rencontre de « gamètes non réduits ». Plantes « naturellement » polyploïdes Caféier arabica (4x = 44) Dactyle (4x = 28) Fraisier de virginie (8x = 56) Luzerne (4x = 32) Bananier (3x = 33) canne à sucre (nx) (n de 10 à 20) pomme de terre (4x = 48) Les plantes aujourd’hui considérées comme diploïdes sont d’anciens autotétraploïdes. La polyploïdisation induite - 1937, Blakeslee découvre l’action de la colchicine : il devient possible d’induire des polyploïdisations chez de nombreuses espèces. Découverte d’autres agents mitoclasiques (ether, NO2,…).

Exemples de la polyploïdisation induite Quelques variétés issues de polyploïdisation induite 1951, Kihara réalise des pastèques triploïdes. 1965, Réveille 1ère variété de ray-grass anglais tétraploïde. 1966, Tétri 1ère variété de trèfle violet tétraploïde. 1968, Monohill, une des premières betteraves triploïdes. 1985, Courtalor «Carnaval» variété de weigela triploïde. Utilisation de la polyploïdisation 1) La polyploïdisation a été utilisée principalement chez les plantes fourragères et ornementales. 2) La triploïdie est une stratégie de choix pour introduire une aspermie 3) La polyploidisation est souvent nécessaire pour tirer parti des hybridations interspécifiques. 4) 2002 1ère autorisation de consommation d’huître triploïde!!!

Une plante haploïde possède le nombre gamétique de chromosomes. Haplodiploïdisation Une plante haploïde possède le nombre gamétique de chromosomes. Haploïdisation spontanée - polyembryonie (ex: asperge), androgenèse in situ (ex: tabac) et gynogenèse in situ (ex: maïs, colza). Androgenèse - Culture d’étamines (1964) : Datura, Tabac ... Plus de 150 espèces… - Culture de microspores isolées (1973) : Datura, Riz, Colza, Orge, Blé, Pomme de terre, Maïs,... Gynogenèse - Culture d’ovaires/ovules (1976) : Orge, Blé, Tabac, Riz, Gerbera, Maïs, Betterave, Tournesol,... - Croisements interspécifiques (1964) : Pomme de terre, Orge, Melon, Blé, Luzerne, Allium, ... - Utilisation de pollen irradié (1983) : Orge, Blé, Pétunia, Melon, Carotte, Concombre, Chou,... « Haplodiploïdisation » = Haploïdisation + doublement (spontanée ou induit) conduit à des « lignées pures »

Exemples d’haplodiploïdisation en amélioration des plantes Principale utilisation de l’haplodiploïdisation Fixation du matériel génétique sous forme de lignées pures: - PLUS RAPIDE - PLUS COMPLETE Quelques exemples de variétés obtenues par haplodiploïdisation Années 50, DEKALB 640, variété hybride double de maïs avec 3 parents haploïdes doublés. Années 70, Maris Haplona, variété de colza. 1974, F211, variété japonaise de tabac. 1978, Lunghua 1, variété chinoise de riz. 1980, Mingo, variété canadienne d’orge. 1987, Florin, variété française de blé. 1989, Adria et Mégal, variétés d’aubergine. 1990, Andréas, variété d’asperge hybride F1 100% mâle. 1995, Osir, variété de piment.

En 1988, plus de 450 espèces pouvaient être micropropagées Micropropagation Micropropagation = Extension des techniques classiques de division de touffes, de bouturage, de marcottage et de greffage qui sont les methodes « horticoles » de clonage. Micropropagation La micropropagation sensu stricto est une multiplication clonale in vitro qui s’appuie sur : la production de bourgeons puis de racines adventives sur un fragment de plante l’embryogenèse somatique, c’est à dire la régénération d’une plante à partir d’une seule cellule Bref historique de la mise au point de la multiplication végétative in vitro 1939, Gautheret réalise une culture indéfinie de cambium. 1952, Morel et Martin réalisent le premier assainissement par culture de méristème de dahlia. 1958, Reinert et Stewart obtiennent les premiers embryons somatiques de carotte. 1960, Morel réalise la première multiplication végétative in vitro de l’orchidée. En 1988, plus de 450 espèces pouvaient être micropropagées

Impact des méthodes de micropropagation sur l’amélioration des plantes Multiplication d’un génotype à l’identique - Microbouturage : séquoia, divers pins, eucalyptus, peuplier, merisier, framboisier, vigne, gerbera, chrysanthème, porte-greffes d’arbres fruitiers,… - Embryogenèse somatique : caféier, pins, mélèzes, épicéas, douglas, palmier à huile,... Sélection sanitaire : élimination des viroses. - Culture de méristèmes: pomme de terre, artichaut, dahlia, vigne, ail, fraisier,… - Thermothérapie: pêcher, agrumes, Allium,... - Microgreffage : agrumes,…

1958 à 1990: de la cellule isolée d’une plante à une plante (identique) régénérée in vitro.

L’hybridation somatique en amélioration des plantes Méthode de combinaison d’information génétique en 3 étapes 1) Réalisation de protoplastes cellules végétales sans paroi, 2) Fusion des protoplastes (fusion cellulaire) 3) Culture in vitro des produits de fusion et régénération d’une plante entière. Quelques applications de la fusion de protoplastes Création de nouvelles espèces - 1978, la pomate. - 2002, porte-greffes de Citrus : Poncirus trifoliata x Citrus reticulata. Introgression de caractères par fusion asymétrique - Résistance au virus de l’enroulement introduite dans la pomme de terre à partir de S. brevidens. Résistance au mildiou à partir de S. bulbocastanum. Manipulation des caractères cytoplasmiques (cybrides) - création de géniteurs pour la production de variétés hybrides chez les Brassica, le riz et l’endive.

Transgenèse Historique 1965 Premiers essais (infructueux) par injection d’ADN dans des graines 1983, Premiers tabacs transgéniques obtenus grâce aux agrobactéries 1985, Premiers riz transgéniques obtenus par transfert direct d’ADN dans des protoplastes. 1988, Premiers maïs transgéniques par « bombardement » d’ADN dans des cellules en culture 1994, Première autorisation de mise sur le marché des plantes transgéniques aux USA.(tomate) 1996 Premières cultures à grande échelle (1.6 Millions d’ha) 2006 Plus de 100 millions d’ha dans le monde (sauf l’Europe)

Qu’est-ce qu’une PGM… Pour la réglementation Européenne: quelque chose qui n’est pas naturel ! « Plante dont le matériel génétique a été modifié autrement que par multiplication ou recombinaison naturelle » (Loi de 1992) « Naturelle » au sens « qui n’a pas été modifiée par l’homme » Définition non scientifique mais « culturelle » c’est-à-dire conforme à l’idée commune (mais fausse) de la « naturalité » des aliments obtenus à partir des plantes et des animaux domestiques L’agriculture, y compris la plus primitive, est-elle naturelle? Le maïs, le chou ou la pomme de terre sont-ils naturels? Le pain, le vin ou la bière sont-ils naturels? Cette définition est un jugement de valeur qui condamne implicitement son objet.

Qu’est-ce qu’une PGM… pour le sélectionneur: Un moyen de créer un caractère qui n’existe pas dans l’espèce considérée ni dans ses apparentées comme par exemple la résistance aux larves d’un coléoptère. Il s’agit en fait du transfert par transformation génétique d’une version « construite » d’un gène. Ce gène peut être construit à partir d’une séquence présente dans la même espèce ou dans une espèce très différente (micro-organisme, animal). Du point de vue méthodologique elle s’apparente à la mutagenèse: en effet, on peut, théoriquement du moins, imaginer, par une succession de mutations repérées au niveau de la séquence d’ADN, reconstruire in vivo une séquence et donc un gène et une fonction qui n’existerait pas dans une espèce. Une telle méthode ne conduit pas à une PGM car l’ADN n’a jamais quitté les cellules de l’espèce.

ARGUMENTS ANTI-PGM Les PGM autorisent le franchissement de la barrière des espèces Tous ces risques n’ont pas été sérieusement étudiés …. C’est confondre la sélection variétale ou les croisements traditionnels avec la production de chimères qui mélangent des espèces très différentes, ou même l’animal avec le végétal Jacques Testart http://jacques.testart.free.fr

il s’agit donc d’une hypothèse de Greenpeace et non d’un fait expérimental

PROTEINES ANTIGEL (DE PLANTES) Des protéines antigel sont retrouvées chez un grand nombre de plantes tolérantes au froid, chez lesquelles elles inhibent la croissance et la recristallisation de la glace qui se forme dans les espaces intercellulaires. Cependant, ces protéines de plantes ont des propriétés structurales différentes de celles des poissons et des insectes……

PROTEINES ANTIGEL (DE PLANTES) protéine antigel de poisson protéine antigel de plante transgenèse TILLING in planta

Evolution des méthodes et techniques de la sélection depuis 200 ans Sélection de descendances homogènes remplace la sélection massale (mélange de différents génotypes pratiquées dès l’origine de l’agriculture (1850) L ’hybridation entre lignées ou espèces et la sélection dans la descendance (1880) Le doublement chromosomique, la mutagenèse (1935) Les méthodes biométriques (1950) Après l’identification des chromosomes (la cytogénétique ) et leur « manipulation » (1950) La culture in vitro, haploïdie, hybridation cellulaire, multiplication végétative, éradication des viroses…(1950-1980) /…Trangénèse…/ 1984 L’identification de marqueurs moléculaires des caractères (1980) L’identification des gènes, de leurs séquences et de leurs fonctions (génomique) (depuis 1990) La sélection de mutants avec modification précise du gène cible (TILLING)(2000)