COURS CELULES SOUCHES (D. Aberdam) 2010 Ma 2/3: cours 1: Définitions et généralités sur les CS Ve 5/3: cours 2: CS somatiques et plasticité Ma 8/3: cours 3: CS hématopoëtiques (Dr. Rouleau) Ve 12/3: cours 4: CS embryonnaires Ma 16/3: Partiel 1 Ve 19/3: cours 5: CS adultes reprogrammées (iPS) Ma 23/3: cours 6: CS embryonnaires et physiopathologie Ve 26/3: Cours 7: CS tumorales + labo Ma 30/3: Partiel 2 Examen: mi-mai

cellules progénitrices (d'amplification transitoire) cellule souche 2. Régénération d'un tissu blessé Tissus à renouvellement rapide: épiderme (2-3 semaines) intestin (10 8 cellules/jour) cellules sanguines (10 12 globules/jour) Tissus ne se renouvelant pas ou peu: muscle (satellites) cerveau (hippocampe, plancher du IV e ventricule) foie (cellules ovales) cœur (?) cellules différenciées 1. auto-renouvellement 2. prolifération 3. différenciation

Mesenchymal connective tissue Cellule souche derme épiderme A quoi sert une cellule souche ? Peau, intestin (10 8 cell/j), système hématopoïétique Peau, intestin (10 8 cell/j), système hématopoïétique globules/jour

1000 rads Till & Mc Culloch, 1961 Greffe de mo ë lle ou autre tissu 6 mois Reconstitution du système immunitaire NK B Mo PN Dend GR Meg CS hématopoïétique Lignées hématopoïétiques T Thérapies liées au système hématopoïétique (ex. leucémie) A quoi sert une cellule souche en thérapie cellulaire ?

Thérapie des grands brûlés

Remplacement transitoire des tissus Efficacité rapide - Progéniteurs endothéliaux, myoblastes - Progéniteurs ilôts  de Langherans -Précurseurs ostéoblastiques / chondroblastiques - Neurones foetaux Remplacement permanent de l’ensemble du tissu- Efficacité retardée - Cellules souches hématopoïétiques -Cellules souches épidermiques -MAPC? CS mésenchymateuses? - Transfusion de globules rouges Remplacement très transitoire Efficacité immédiate La position hiérarchique définit l’efficacité thérapeutique Cellules souches Précurseurs matures Progéniteurs intermédiaires

Totipotentes (> 200 types cellulaires) (ne se reproduisent pas) stade 8 cellules (3 jours) cellules souches de sang de cordon Pluripotentes ou multipotentes Nouveau-né œuf fécondé (jour 1) Cellules de carcinome embryonnaire (EC) Pluripotentes Tératocarcinome (cellules tumorales testiculaires) embryon pré-implantatoire Pluripotentes cellules souches embryonnaires (ES) trophoblaste Bouton embryonnaire (ICM) cellules souches germinales embryonnaires (EG) Pluripotentes Embryon de 6 semaines cellules foetales Pluripotentes ou multipotentes cellules souches adultes Multipotentes et unipotence adulte

Pourquoi s’interesse-t-on aux cellules souches ? 1. Etude des mécanismes de différenciation 2. Evaluation d’un potentiel thérapeutique 3. Comprendre des pathologies liées à l’auto-renouvellement et à la différenciation (cancer).

Comment identifier les cellules souches adultes ? EXCLUSION DU COLORANT “LABEL-RETAINING ABILITY” CLONOGENICITE IN VIVO RECONSTITUTION MARQUEURS DE SURFACE EVIDENCES INDIRECTES :

Hoechst blue (440 nm) Hoechst red (675 nm) Verapamil (inh. du transporteur ABC) EXCLUSION DU COLORANT “LABEL-RETAINING ABILITY” CLONOGENICITE IN VIVO RECONSTITUTION MARQUEURS DE SURFACE EVIDENCES INDIRECTES : Le transporteur “ATP-binding cassette transporter” expulse le colorant vital. Excitation à 350 nm (UV) Emission fluorescence à 2 différents. Comment identifier les cellules souches adultes ?

EVIDENCES INDIRECTES: 4 semaines de chasse sans BrdU Impossible chez l'homme (greffe) Injection de 5-bromo-deoxyuridine (BrdU), cellules différenciées assise basale (couche proliférative) BrdU remplace la dT EXCLUSION DU COLORANT “LABEL-RETAINING ABILITY” CLONOGENICITE IN VIVO RECONSTITUTION MARQUEURS DE SURFACE

paraclone holoclone méroclone EVIDENCES INDIRECTES : Comment identifier les cellules souches adultes ? Ensemencement en condition diluée EXCLUSION DU COLORANT “LABEL-RETAINING ABILITY” CLONOGENICITE IN VIVO RECONSTITUTION MARQUEURS DE SURFACE

Localisations principales des kératinocytes clonogeniques glande sébacée bulge bulbe faible activité mitotique in vivo forte activité mitotique in vivo forte activité clonogénique in vitro faible activité clonogénique in vitro (BrdU, 3 H-Thy)clonogénicité

1000 rads Till & Mc Culloch, 1961 Greffe de mo ë lle Reconstitution d’un système hématopo ïé tique Contribution tissulaire 6 mois EVIDENCES INDIRECTES : Traitement des leucémies (pathologies du système hématopo ïé tique) Comment identifier les cellules souches adultes ? EXCLUSION DU COLORANT “LABEL-RETAINING ABILITY” CLONOGENICITE IN VIVO RECONSTITUTION MARQUEURS DE SURFACE

Multipotence des cellules souches épidermiques Transfert du greffon sur souris nude 10 semaines épiderme glande sébacée follicule pileux multipotence Transplantation in utero d'un bulge ß-gal

Plusieurs classes de cellules souches épidermiques Ghazizadeh and Taichman (2001) Embo J 20, En condition de réparation ou également en situation physiologique ?

CD34+ DR- CD38- CD33- CD7+ CD19+ CD13+ CD34- CD34+ DR+ CD38 + CD3 + CD41+ CSH Monocytes Polyneutrophiles Hématies Mégacaryocyte (plaquettes) Cellules dendritiques Lymphocyte B Natural Killer Lymphocyte T EVIDENCES INDIRECTES : CD= cluster designation Comment identifier les cellules souches adultes ? EXCLUSION DU COLORANT “LABEL-RETAINING ABILITY” CLONOGENICITE IN VIVO RECONSTITUTION MARQUEURS DE SURFACE

Le concept de "niche" épiderme follicule pileux glande sébacée progéniteur multipotent cellules différencées Cellule souche Cellule souche Notch Wnt (ß-caténine/LEF1) c-Myc BMPs Influence réciproque

épiderme follicule pileux glande sébacée progéniteur unipotent cellules différencées Cellule souche Cellule souche

épiderme derme Trichofolliculoma (ß-caténine, PTEN) & Pilomatricoma Sebaceous Adenoma (LEF-1, MSH2) Basal cell Carcinoma (SHH, p53) cancers cutanés Papilloma & Squamous cell carcinoma (Ras, p53, PTEN)

Invertébrés: Cnidaires: méduses, les coraux, les anémones de mer et autres polypes. Persistence d’une niche de cellules totipotentes, recrutées en cas de lésion. Plasticité des cellules souches hydre plathelminthe: vers plats Coupé, formera autant de vers complets!! Regénère même sa tête!!

Vertébrés: salamandre (régénère tous ses membres (œil, queue, portions de cœur) amphibiens nocturnes, de l’ordre des urocèles Les cellules à proximité de la lésion (surtout fibres musculaires) se dédifférencient pour former un blastème régénératif contenant des progéniteurs mésenchymateux. Plasticité des cellules souches Cicatrisation (Days 1-2) Dé-differenciation (Days 3-12) Formation du blastème (Days 13-21) Re-différentiation (Days 22-40)

Plasticité des cellules souches Differentiation Proliferation Epimorphosis Salamandre Cellules souches ou progénitrices Dedifferentiation recrutement de néoblastes hors de l’organe blessé (forte prolifération) Differentiation Morphallaxis (allaxis= exchange) Hydre La régénération d’une partie du corps se fait par une réorganisation cellulaire et structurale avec un nombre restreint de nouvelles cellules (pas de prolifération) Cellules souches totipotentes

A quoi est due cette incapacité régénératrice chez l’Homme? Absence de persistence de cellules totipotentes? (Hydre) Limitation du niveau de dédifférenciation? (Salamandre) Et pourtant …….

“Transdifférenciation (plasticité)” CŒUR cardiomyocytes PEAU Kératinocytes Fibroblastes Adipocytes (liposuccion) astrocytes neurones oligodendrocytes Précurseurs neuronaux CERVEAU MOELLE OSSEUSE CSH Brain to blood ! Révolution de dogmes: - passage au travers des feuillets embryonnaires ? -potentiel en médecine régénératrice ? PANCREAS (Seaberg 2004 Nat Biotech Choi 2004 Stem cells) pancreatic endocrine ß-,  - and  -cells, pancreatic exocrine, stellate cells FOIE hépatocytes Muscle squelettique Cellules endothéliales Chondrocytes ostéocytes

1000 rads Till & Mc Culloch, 1961 Greffe de mo ë lle ou autre tissu 6 mois Protocole date de 1961 mais la plupart de ces observations faites entre 1999 et 2004!!!!! Observation dans les différents tissus chez la souris et post mortem chez l’homme (receveur de greffe de MO)

Multipotent Adult Progenitor Cells (MAPC)

(Jiang et al. Nature , 41-9) -Conversion à l’échelon clonal des MAPC en: - cellules endothéliales, -ectodermiques et endodermiques, in vitro et in vivo

Thérapie cellulaire: Réparer une fonction déficiente 1.Reconstitution du tissu d'origine 2.Reconstitution d'un tissu autre que celui d'origine (plasticité) Skeletal muscle

Malheureusement, l’Homme n’est ni une hydre, ni une salamandre… Contaminant de cellules circulantes Population hétérogène (non clonale) Rareté des CS adultes Fusion cellulaire

Promoter oct4- gfp/puromycin Isolement de cellules neurales puro R et gfp + Cellules ES Cerveau

cell fusion causes confusion! Promoter oct4- gfp/puromycin Isolement de cellules neurales puro R et gfp + Cellules ES Cerveau