rFVIII-PEG-Lip Augmentation de l’efficacité du facteur VIII formulé avec des liposomes pégylés (rFVIII-PEG-Lip) chez les souris hémophiles Pan J et al Blood 2009; 114: Enhanced efficacy of recombinant FVIII in noncovalent complex with PEGylated liposome in hemophilia mice

Contexte Il a été rapporté précédemment que le FVIII recombinant (rFVIII) formulé avec des liposomes pégylés (rFVIII-PEG-Lip) augmente le nombre de jours sans saignement de 7 à 13 jours à la dose de 35UI/kg chez les patients hémophiles A sévères (Russia I study, Baru M, T&H 2005) et de 6 à 11 jours à 25 UI/kg (Russia II study, Spira J, Blood 2006). Cependant les études de pharmacocinétique dans un essai américain de phase I n’ont pas montré de différence entre le rFVIII et le rFVIII- PEG-Lip (Powell JS, JTH 2008). L’hypothèse a été émise que, via l’association aux PEG-Lips, une faible fraction de rFVIII est localisée au niveau cellulaire et subcellulaire sanguins incluant les microparticules. Le rFVIII serait ainsi protégé du processus d’activation de l’hémostase et non détecté dans les tests plasmatiques. Afin de comprendre ces résultats, cette étude se propose de faire le point avec les travaux chez la souris hémophile. Pan J et al Blood 2009; 114: rFVIII-PEG-Lip

Méthodologie Modèle animal Souris hémophile A knockout Evaluation de l’efficacité Section de la veine de la queue Thromboélastométrie (ROTEM) in vitro Interaction entre le rFVIII-PEG-Lip et les cellules Effet sur les fonctions plaquettaires rFVIII-PEG-Lip Pan J et al Blood 2009; 114: rFVIII-PEG-Lip

Résultats Pan J et al Blood 2009; 114: Heures post TVT AB rFVIII-PEG-Lips entraine une augmentation d’efficacité, comparativement au rFVIII qui nécessite une liaison avec les PEG-Lips. Augmentation de l’efficacité Efficacit é accrue des rFVIIl-PEG-Lip, apr è s section de veine caudale chez la souris Hema. (A) Les souris Hema ont re ç u dans la veine caudale soit une formulation tampon de 50μL rFVIII (excipient) soit le rFVIII à la dose de 4,13, 40,100 et 200 UI/kg. 24 h plus tard, l'une des veines caudales lat é rales a é t é sectionn é e et le % de souris ayant survécu à la blessure a été contrôlé à chaque heure pour les 11 premières heures puis à 24 heures. (B) Courbe dose-réponse rFVIII en % de survivants après section de veine caudale, cf tableau A. (C) Comparaison des courbes de survie des souris Hema traitées soit avec une formulation tampon de 13 UI/kg rFVIII, soit avec le PEG-liposome, soit en injection séquentielle de PEG-liposomes suivies par le rFVIII, soit enfin par 50 µL PEG-liposome (excipient). Les valeurs du p entre deux queues ont été déterminées par le log-rank test sur les courbes de survie respectives. rFVIII-PEG-Lip

Résultats Pan J et al Blood 2009; 114: La demi-vie n’est que modérément prolongée lors de l’utilisation de rFVIII-PEG-Lip Demi-vie Pharmacocin é tique de rFVIII et de rPVIII-PEG-LLP chez la souris HemA. (A) Un profil repr é sentatif de cin é tique plasmatique. Dans cette exp é rience, les souris HemA ont re ç u soit 116 Ul / kg rFVIII ( ) ou 70 Ul / kg- rFVIII PEG-Lip ( ◊ ).Le sang citrat é a é t é recueilli à 5 minutes et à 4, 8,16,24, 32 et 48 heures apr è s l'injection dans la veine caudale. L ’ activit é du FVIll plasmatique a é t é mesur é e par Coatest. Les r é sultats pr é sent é s sont une moyenne de 5 souris / traitement à chaque instant. Les courbes de d é croissance ont é t é adapt é es en mod è le non compartimental avec é chantillonnage clairsem é dans WinNonLin. (BC) Les souris HemA ont re ç u soit 1,5 UI (2 x 105 cpm) / souris de 125 l-rFVIII reconstitu é dans un tampon ( ) soit le PEG-liposomes ( ◊ ). La d é croissance de 125 I-FVMI à la fois dans le sang total (B) et sur plasma pauvre en plaquettes (G) a é t é suivie à 5 et 30 minutes, et à 1, 4, 8, 16, , 72 et 96 heures. Les r é sultats pr é sent é s correspondent aux é missions gamma individuelles de 5 souris à chaque instant et pour chaque traitement. Les courbes de d é croissance ont é t é adapt é es grâce au mod è le bi- compartimental de WinNonLin. rFVIII-PEG-Lip

Résultats Pan J et al Blood 2009; 114: Microparticules Les microparticules sont indispensables à l’augmentation d’efficacité du rFVIII-PEG-Lip rFVIII-PEG-Lip L'activité de coagulation accrue des rFVIII-PEG-Up est extraite du PPP par ultracentrifugation. Des souris HemA ont reçu des doses de 8 UI / Kg rFVIII (n=20) ou rFVIll-PEG-Lip (n= 20). A 5 minutes après l'administration, le sang était prélevé dans la veine cave et testé individuellement par ROTEM. (A) Du sang total (3 µL) a été ajouté à 300 µL de sang recueillis auprès de souris HemA naïves. (B) Le sang de chaque souris a été centrifugé à 300g pendant 5 minutes et 3 µL de la fraction PRP (surnageant) ont été ajoutés à 300 µL de sang fraichement collecté de souris HemA naïve. (C) Immédiatement après la collecte de 3 µL de PRP issu de la centrifugation à petite vitesse, le sang de chaque souris a de nouveau été centrifugé à 1500g pendant 5 minutes. Trois microlitres de la fraction PPP (surnageant) a été ajouté à 300 µL de sang fraichement collecté de souris HemA naïve. (D) Du plasma décongelé a été soumis à une ultracentrifugation à g pendant 20 minutes et 3 µL du surnageant ont été ajoutés à 300 µL de sang fraichement collecté de souris HemA naïve. Les valeurs de p entre deux queues ont été déterminées par test de Mann-Whitney. P> 0.05 pour PPP d’animaux traités par UFP versus fFVIll ; P = 0,016 pour PPP d’animaux traités par UFP versus rFVIII-PEG-Lip; P = 0,008 pour PPP d’animaux traités par rFVIII versus rFVIH-PEG-Lip ; et P> 0.05 pour UFP d’animaux traités par rFVIII versus rFVIjl-PEG-Lip.

Résultats Pan J et al Blood 2009; 114: Plaquettes Les PEG-Lips sont associés aux plaquettes et aux monocytes et favorisent l’activation plaquettaire. La majorité des plaquettes et monocytes est associée avec le PEG-liposomes. Des souris HemA ont reçu dans la veine caudale une injection de PEG-liposome ou de FLTC marqué PEG-liposomes (FITC-PEG-Lip) soit seul, soit formulé avec 0,2 rFVIll UI (FITC-PEG- Lip/rFVIll). Cinquante microlitres de sang ont été échantillonnés à 0,5, 24 et 48 heures et analysés par cytométrie de flux. (A) Tri de profils cellulaires activés en fluorescence sur des échantillons de sang provenant d’une souris HemA représentative traitée par le FITC-PEG- Lip. Les plaquettes étaient marquées par des anticorps monoclonaux fluoro-conjugués dirigés contre les CD41 et CD61 de souris. Un seuil de fluorescence pour le FITC a été défini comme celui qui a fait chuter de 99% tous les événements plaquettaires sur le sang injecté avec du PEG-liposomes non marqué. (B) Pourcentage de plaquettes CD41+, CD61+ marqu é es au FITC-PEG-liposomes chez les souris HemA trait é es avec FITC-PEG-Lip seul ou FITC-PEG-Lip formul é avec rFVIII. Les résultats présentés sont une moyenne ± écart- type de 7 souris à chaque instant. (C) Tri de cellules activées en fluorescence à partir du sang d’une souris HemA traitée au FITC-PEG-Lip, dans lequel les monocytes et les lymphocytes ont été identifiés par le profil caractéristique de diffusion de la lumière. Le sang des animaux non marqués ayant reçu du PEG-liposome a été utilisé pour déterminer les seuils FITC (FL1)-négatif (axe des x) et non marqués (FL4)-négatif (axe des y) pour chaque type cellulaire afin de corriger l’auto-fluorescence cellule-dépendante. En ce qui concerne le traitement au FLTC-PEG-Lip, le signal FITC cellule-dépendant (axe des x) a augmenté, tandis que le signal de fluorescence non marqué (axe des y) est resté constant. rFVIII-PEG-Lip

Conclusion L’augmentation de l’efficacité du rFVIII-PEG-Lip semble médiée par les plaquettes et la production de microparticules permettant l’expression de récepteurs de haute affinité pour le FVIII. Pan J et al Blood 2009; 114: rFVIII-PEG-Lip