Apport de l’amplification multiplex puis séquençage NGS des 5 gènes majeurs de Cardiomyopathie Hypertrophique : Spectre des mutations et CNVs chez 1259 patients Flavie Ader Dr Pascale Richard UF Cardiogénétique et Myogénétique, Service de Biochimie Métabolique, Paris, (F ), France, Hôpitaux Universitaires de la Pitié- Salpêtrière- Charles Foix, Paris – France

2 Cardiomyopathies Hypertrophiques Hypertrophie du ventricule gauche, souvent asymétrique (septum) caractérisée par un septum interventriculaire ≥ 13 mm. Prévalence: 1/500 Transmission: dominante Pénétrance: variable selon l' âge et gène dépendant Hétérogénéité génétique: mutations privées Hétérogénéité clinique: variabilité inter individus et intrafamiliales Patient asymptomatique Trouble du rythme Insuffisance cardiaque Mort subite Diagnostic: échographie cardiaque Assises de Génétique- 3-5 Février Lyon France

3 Etiologie des cardiomyopathies hypertrophiques Histologie (ME) pathology.jhu.edu Maron BJ. et al, The Lancet, Assises de Génétique- 3-5 Février Lyon France MYBPC3 TNNI3, TNNT2 MYH7, MYL2

4 Cardiomyopathies : Aspects génétiques 1987: découverte du premier gène MYH7 5 gènes majeurs MYH7, MYBPC3, MYL2, TNNI3, TNNT2 Elliott et al. ESC Guidelines, EHJ 2014;35(39): Assises de Génétique- 3-5 Février Lyon France

5 Apport des nouvelles technologies de séquençage Etude rétrospective sur les 1259 cas de CMH ayant bénéficié d’un screening par NGS des 5 gènes majeurs des CMH (MYH7, MYBPC3, TNNT2, TNNI3, MYL2) Apport du NGS ? Rendement mutationnel ? Détection de nouveaux types de mutation ? Assises de Génétique- 3-5 Février Lyon France

6 Matériel et méthodes (1/2) 1259 patients atteints de CMH (séries de 96 patients) Technologie Multiplicom (MASTR Assay Cardiomyopathy) amplification multiplex des 5 gènes majeurs de CMH (MYH7, MYBPC3, MYL2, TNNI3, TNNT2) Cibles : exons codants = 135 fragments (23 Kb) dont 5 amplicons contrôle (5 plexs) Séquençage de 96 patients/run Flow cell 2*300 V3, Miseq® Illumina Gene scan fragments d’amplification Assises de Génétique- 3-5 Février Lyon France

7 1) Amplification PCR multiplex des exons cibles dans 5 plexs différents pour chaque patient 2) Tous les fragments amplifiés sont indexés avec des MID et des séquences nécessaires au séquençage (grands fragments pb) 3) Multiplexage des plexs d'un patient 4) Mutiplexage des 96 patients et séquençage par bridge amplification (Miseq®) Matériel et méthodes (2/2) Assises de Génétique- 3-5 Février Lyon France

8 Visualisation des résultats SeqPilot ®: Alignement des séquences Hg19, et annotation des variants Interprétation des variants: Qualité des séquences (> 30x, équilibre R1/R2) Fréquence rare dans la population (<0,1 %), (EVS, 1000G, ExaC) Sites de prédiction in silico de la conséquence protéique (SIFT, Polyphen, GVGD, Mutation taster) Assises de Génétique- 3-5 Février Lyon France

9 Validation de la technologie en diagnostic Sensibilité: * Couverture moyenne par cible * Capacité à détecter tout type de mutation (substitutions, Indel, CNVs) Spécificité: pas d’amplification des gènes homologues (MYH6) Répétabilité: intra run Reproductibilité: inter-run, inter-techniciens Exemple de couverture cumulée par gènes, série 9 (Kit V3) – 96 pts Assises de Génétique- 3-5 Février Lyon France

10  Séquençage des patients amène à un diagnostic chez 38 % (n=476/1259) patients.  90 % des patients (n=429) sont porteurs d’un variant pathogène et 10 % (n=47) de deux variants pathogènes Résultats (1/5): Analyse des 5 gènes majeurs Assises de Génétique- 3-5 Février Lyon France

11 Résultats (2/5): Distribution des gènes 271 mutations différentes identifiées  147 dans le gène MYBPC3  84 dans le gène MYH7  20 dans le gène TNNT2  13 dans le gène TNNI3  7 dans le gène MYL2 Distribution des gènes majeurs des CMH chez les patients mutés (n= 476) Assises de Génétique- 3-5 Février Lyon France

ELEMENTS CONNUS  Taux de diagnostic de 38 %  Distribution des gènes chez les patients génotypés conforme à la littérature AVANTAGES  5 gènes simultanément  Gain sensibilité si doubles mutants  Nombre de patients testés (96 par run/mois) – gain de débit/temps  Facilité d’interprétation (20-40 variants/patient) 12 Résultats (3/5): Apports de la technique → SNV et insertion/délétion de petites tailles, largement décrits → Peu d'études des variations structurales de type CNVs Assises de Génétique- 3-5 Février Lyon France L.R. Lopes et al. European Journal of Medical Genetics 58 (2015)

13  Analyse des CNVs (Genodiag®) RC amplicon normalisé ROI Référence RC normalisé ROI (RC amplROI/ Somme RC amplcontrol) 1 échantillon moyenne (RC amplROI/ Somme RC amplcontrol) tous les échantillons  Ratio 1,3 duplication suspectée  Interprétation : 1) qualité technique (≤ 2 patients porteurs du même CNV) 2 ) amplicons contigüs touchés 3) qualité de l’ADN (≤ 2amplicons avec un CNV/patient)  Vérification : MLPA (MYBPC3, MYH7, TNNI3) ou par qPCR Résultats (4/5) : Détection des CNVs Assises de Génétique- 3-5 Février Lyon France

14 Résultats (5/5): Détection des CNVs 14/1259 patients sont porteurs d’un CNV  MYBPC3 : 7 délétions et 1 duplication  MYH7 : 1 délétion  MYL2 : 2 délétions  TNNI3 : 1 délétion  TNNT2 : 1 délétion et 1 duplication Délétion exons 24 à 33 MYBPC3 Fréquence estimée des CNVs des 5 gènes majeurs dans les CMH environ 1 % Assises de Génétique- 3-5 Février Lyon France

15 Conclusions  Analyse simultanée des 5 gènes majeurs  Détection des CNVs → Elargissement du spectre des anomalies moléculaires responsables de CMH  Multiplexage par 96 patients/série permet un rendu diagnostic plus rapide  Interprétation bioinformatique plus rapide et fiable  Meilleur conseil génétique aux patients et aux familles Assises de Génétique- 3-5 Février Lyon France

16 Elliott et al. ESC Guidelines, EHJ 2014;35(39): Rapezzi et al. ESC WG Position Paper, EHJ 2013;34:1448. Workflow du conseil génétique aux patients dans les CMH Assises de Génétique- 3-5 Février Lyon France

17 Remerciements  Centre de référence national des maladies cardiaques Héréditaires P. Charron  Centres de compétence en France  Bordeaux  Lille  Rouen  Toulouse  Dijon  …………..  UF Cardiogénétique et Myogénétique P. Richard F. Ader C. Vegas N. Caillaud L. Demay K. Gaudon S. Lebreton

18 Variation structurales : CNVs L.R. Lopes et al. European Journal of Medical Genetics 58 (2015) cas index atteints de CMH génotypés par NGS capture sur 41 gènes de cardiomyopathies CNVs retrouvés chez 4 patients (0,8 % de la cohorte)  une large délétion du gène MYBPC3  une large délétion du gène PDLIM3  une duplication entière du gène TNNT2  une large duplication du gène LMNA Assises de Génétique- 3-5 Février Lyon France