1 LA REGENERATION HEPATIQUE

2 Il existe un rapport relativement constant entre le poids du foie et le poids du corps chez l’homme (ainsi que chez de nombreux animaux de laboratoire) La taille du foie chez l’adulte correspond au rapport optimal entre la masse fonctionnelle du foie et la masse de l’organisme entier Toute déviation de ce rapport optimal est rapidement corrigée

3 diminution de la masse fonctionnelle du foie hépatectomie partielle transplantation hépatique foie-réduit destruction des hépatocytes réplication hépatocytairecroissance hépatique apoptose hépatocytaire transplantation d’un greffon de grande taille certains médicaments induisant une hyperplasie hépatocytaire (ex contraceptifs) transplantation hépatique hétérotopique rapport optimal entre masse fonctionnelle hépatique/masse corporelle

4 Hépatectomie partielle Hépatocytes ¢ biliaires ¢ endothéliales prolifération veine centrolobulaire espace porte La synthèse d’ADN commence 10 à 12h après la chirurgie et s’arrête après environ 3 j Les hépatocytes engagés ds la prolifération assurent leurs fonctions métaboliques (métabolisme glucidique)

5 Il existe certains réarrangements microscopiques: aspect de travées épaisses observé chez l’embryon et le jeune enfant. Les hépatocytes qui prolifèrent semblent, au moins partiellement, revenus à un phénotype fœtal et expriment des marqueurs tels que l’  -foetoprotéine. Les hépatocytes qui prolifèrent forment initialement des amas qui sont rapidement transformés en couches classiques. Les cellules endothéliales qui prolifèrent développent rapidement les pores membranaires caractéristiques des sinusoïdes.

6 Stimuli de la régénération mitogènes hépatocytaires et cytokines (HGF, TGF , TGF , IL1  ) oncogènes cellulaires (c-fos, c-jun, c-myc) communications intercellulaires  Régénération hépatique = équilibre complexe entre facteurs stimulants et inhibiteurs :  Elle débute par une synthèse d’ADN, suivie d’une prolifération hépatocytaire initiée par la sécrétion d’HGF  Elle est entretenue par les principaux mitogènes hépatocytaires : HGF, EGF, et TNF   Après restauration de la masse hépatique initiale, la prolifération s’interrompt modulent la prolifération des H et l’expression des gènes de fonctions spécifiques et différenciés Le TGF  joue un rôle essentiel dans cet arrêt de la régénération

7 Elle est déclenchée par des agents mitogéniques et de croissance (dans le sang circulant):  Le niveau d’HGF augmente beaucoup, très vite après une hépatectomie partielle. C’est le seul facteur mitogène puissant pour les hépatocytes isolés, cultivés  Le TNF  stimule la prolifération des cellules endothéliales  L’IL-6 est un mitogène de l’épithélium biliaire  La noradrénaline potentialise l’activité mitogénique de l’EGF et de l’HGF  L’insuline est nécessaire et joue plutôt un rôle favorisant Stimuli de la régénération

8 Agents régulant l’arrêt de la régénération:  TGF-  1 (agit sur la prolifération des hépatocytes)  ?

9 Hépatectomie 70% Réplication hépatocytes > 95 % (rats jeunes et souris) « phase pré-réplicative » 12-14h chez le rat h chez la souris synthèse d’ADN Pic à 24h chez le rat Pic à 40 h chez la souris Mitose Masse hépatique restaurée en 10 à 14 jours Dans la régénération du foie après hépatectomie partielle, la reproduction de cellules apparaît en absence de cellules mortes, de fibrose, ou d’événements inflammatoires.

10 molécules d’adhésion et protéines des jonctions  Les hépatocytes perdent leurs interconnexions (1 contre 5-6) Apparition de nouveaux sinusoïdes synthèse de laminine (protéine de la matrice extracellulaire) les cellules nouvellement créées ne sont pas incorporées immédiatement dans une structure lobulaire La restructuration lobulaire survient plusieurs heures plus tard hépatectomie partielle

11 La régénération hépatique représente le passage de cellules en état quiescent dans le cycle cellulaire de la multiplication

12 synthèse d'ADN mitose G0G0 La réplication s’arrête en raison de nombreux mécanismes de contrôle dont le but est de prévenir une prolifération démesurée Les hépatocytes ont un très grand potentiel réplicatif 10 % du nombre total de cellules peut reconstituer le foie en entier ce processus nécessite plus de 10 cycles de réplication LES PHASES DU CYCLE CELLULAIRE

13 G0G0 Initiation ou phase de compétence Activation de facteurs transcriptionnels et réponse précoce immédiate Progression réponse secondaire et expression des gènes du cycle cellulaire aboutissant à la synthèse d’ADN

14 Des facteurs circulants régulent les deux grandes transitions du cycle cellulaire des hépatocytes les cytokines (TNF  et IL 6) contrôlent la transition G0/G1 du cycle cellulaire

15 les facteurs de croissance, EGF, TGF  ou HGF, contrôlent le franchissement du point de restriction (pR) aux deux tiers de la phase G1 et la transition G1/S. Ces points marquent l'initiation de la réplication de l'ADN et le début de l'indépendance du cycle cellulaire vis-à-vis de facteurs extracellulaires.

16 La progression au travers des différentes phases est caractérisée par une activation séquentielle de gènes ou de protéines déjà existantes sous une forme inactive gènes très précoces (c-jun, c-fos), gènes précoces (c-myc) tardifs (p53, cycline D1)

17 Hépatectomie partielle Cycles de transcription c-fos c-jun cyclines mitoses Réplication ADN c-myc p53 mdm2 heures Réplication ADN et mitoses Régénération hépatique gènes très précoces (c-jun, c-fos), gènes précoces (c-myc) gènes tardifs (p53, cycline D1)

18 On estime que la régulation de la régénération hépatique peut être divisée en:  événements réversibles (phase d’initiation), préparant le foie pour la régénération  événements spécifiques au processus de régénération (phase de progression) qui sont irréversibles et qui mènent la cellule à la synthèse d’ADN

19 les cytokines (TNF  et IL 6) contrôlent la transition G0/G1 du cycle cellulaire le stress chirurgical a la capacité d’initialiser les hépatocytes quiescents en les faisant entrer dans le cycle cellulaire Ainsi, l’intervalle de temps entre l’hépatectomie partielle et le pic de synthèse d’ADN est raccourci

20 Les cytokines et les facteurs de croissance agissent sur les hépatocytes quiescents pour initialiser la régénération mais agissent-ils simultanément ou les uns après les autres ?

21 Beaucoup d’autres événements apparaissent rapidement après une hépatectomie partielle: changements  des flux d’ions,  du potentiel redox,  des systèmes de transport des acides aminés,  de la composition des groupes d’acides aminés,  et des nivaux de cAMP

22 Déclenchement de la régénération hépatique 3 mécanismes peuvent être proposés  Activation de gènes de la réponse-croissance, provoquée par des changements métaboliques rapides, conséquences de la diminution de la masse fonctionnelle  Activation des gènes au début de la régénération du foie, déclenchée par  concentration des facteurs de croissance circulants  Adaptations métaboliques rapides apparaissant  immédiat t après l’opération et rendant les hépatocytes capables de répondre aux facteurs de croissance extra et intra-hépatiques qui activent les gènes de croissance

23 La réponse génique immédiate premiers gènes identifiés : c-fos, c-jun, et c-myc  activés dés la première heure après l’opération  Leurs ARNm  rapidement après hépatectomie partielle, pic 1 à 3 h après intervention chirurgicale puis retour aux valeurs normales après 4 h Ainsi c-fos, c-jun et c-myc présentent une induction rapide, séquentielle et transitoire en réponse à une hépatectomie partielle

24 Ils codent pour:  des facteurs de transcription,  des récepteurs de facteur de croissance,  des protéines de liaison,  des protéines de la membrane,  des tyrosines phosphatases,  des protéines de la coagulation (La réponse précoce immédiate concerne d’autres gènes (  70) codant pour des protéases, des phosphatases, des inhibiteurs ou des stimulateurs des facteurs transcriptionnels, des enzymes)

25 G1

26 Activation des facteurs transcriptionnels NF  B, STAT3, AP1, C/EBP les protéines NFkB participent à l’activation de gènes impliqués dans des mécanismes de défense, les réactions immunitaires et la prolifération cellulaire. NFkB est sous une forme inactive dans le cytoplasme: 2 sous-unités, p50 et p65, attachées à un inhibiteur appelé I-kB (inhibiteur de kB). L’activation de NFkB dépend de la dégradation de I-kB et de sa dissociation de ce complexe. NF  B

27 p65 p50 IBIB p65 p50 IBIB p65 p50 p65 p50 p65 p50 Stimulus de la ¢ = Hépatectomie partielle Production de RLO P UBI IBIB P Phosphorylation de I  B par une phospho- rylase induite par RLO Ubiquitination de P-I  B dans protéasomes Protéolyse de UBI- P-I  B Migration vers le noyau Migration dans noyau Transcription de gènes forme active de NF-kB

28  Le composant p65 du NF-kB est essentiel pour le développement hépatique  Son absence entraîne la mort in utero (apoptose hépatique massive)  Il pourrait agir comme stimulateur de la prolifération ¢ ou comme «facteur de survie» ayant un rôle anti-apoptotique Etat des connaissances sur le rôle de NF-kB dans la régénération hépatique

29 Hépatectomie partielle PHFi PHFa 10 min X 400 X min LR-IF1 PHF= facteur d’hépatectomie partielle = complexe protéique proche de NF  B LR-IF1= facteur d’inhibition de la régénération hépatique = inhibiteur spécifique de NF  B  immédiat t La liaison de NFkB aux mêmes sites  aussi à la 1 re h après l’hépatectomie partielle, mais + lentement que PHF: ces facteurs de transcription sont présents dans le foie normal dans une forme inactive; ils sont activés presque immédiatement après l’hépatectomie partielle Liaison aux sites NFkB du DNA qq min.

30 Cette liaison est un des changements les plus précoces dans la régulation des gènes détectés après une hépatectomie partielle et elle serait peut être la première étape de la réponse des gènes après l’opération. Au début de la régénération hépatique, l’activation du gène IkB  supprime la liaison de NF-kB et augmente l’activation du FPH.

31 NF-kB régulable stimuli extra ¢ tels que TNF  signaux intra ¢ activant une protéine kinase état redox (phosphorylation d’IkB) surproduction de RLO grande activité métabolique du foie restant changements dans le potentiel de membrane hépatocytaire par les protéases du protéasome (dégradation d’IkB)

32 Charge métabolique élevée mitochondrie RLO TNF  TNFR-I = récepteur Activation de NFkB Transcription du gène Hépatectomie partielle

33 Activation des facteurs transcriptionnels NF  B, STAT3, AP1, C/EBP STAT3  C’est un facteur de transcription entre les stimuli reçus à la mb. ¢ et l’activation des gènes dans le noyau  Il peut être activé par EGF, LPS et IL6  Il est présent dans le cytosol sous forme inactive, nécessitant 2 étapes de phosphorylation

34 Activation des facteurs transcriptionnels NF  B, STAT3, AP1, C/EBP STAT3  L’activation de STAT3 augmente lentement après hépatectomie partielle mais se prolonge pendant 6 heures ou plus  Ce facteur transactive vraisemblablement des gènes impliqués dans la réponse précoce immédiate et des gènes impliqués dans le cycle cellulaire et qui appartiennent à la réponse secondaire

35 Activation des facteurs transcriptionnels NF  B, STAT3, AP1, C/EBP AP1  Après hépatectomie partielle, son activation survient rapidement et de façon transitoire et, retourne à des valeurs normales en 6 h  aussi appelé liver regeneration factor-1 (LRF-1)  Il est formé d’hétérodimères entre c-Fos et des membres de la famille Jun

36 Activation des facteurs transcriptionnels NF  B, STAT3, AP1, C/EBP AP1  La composition des complexes AP1 changerait au cours des premières heures après hépatectomie partielle. Ainsi, les différents complexes AP1 transactiveraient des gènes de la réponse précoce immédiate et des gènes de la réponse secondaire  L’activité de liaison de c-Jun au sein des complexes AP1 augmente dans l’heure qui suit l’hépatectomie partielle

37 Activation des facteurs transcriptionnels NF  B, STAT3, AP1, C/EBP  Fortement exprimé dans le foie normal  même famille qu’AP1  active des gènes « spécifiques du foie » fortement exprimés dans les hépatocytes différenciés  Deux composants importants : isoformes C/EBP  et C/EBP  C/EBP (CAAT enhancer binding protein)

38 Activation des facteurs transcriptionnels NF  B, STAT3, AP1, C/EBP  Après hépatectomie partielle: C/FBP   et C/EBP   Ces changements persistent jusqu’à ce que la première vague de synthèse d’ADN soit achevée  L’augmentation du rapport entre le C/EBP  et le C/EBP  après hépatectomie partielle permettrait une réplication hépatocytaire sans perte du phénotype C/EBP (CAAT enhancer binding protein)

39 La réponse primaire comporte la transactivation d’autres séries de gènes qui vont faire partie de la phase d’activation retardée, encore appelée réponse secondaire.

40 Autres gènes participant à la réponse primitive PRL1 code la tyrosine phosphatase PAI1 similitudes structurales avec HGF et activateur de TGF b1 IGFBP1 peut moduler l’activité du facteur de croissance EGF récepteur dont l’ARNm augmente 1 à 3 h après hépatectomie partielle

41 Elle comporte l’augmentation de l’expression des gènes du cycle cellulaire comme les cyclines et leurs kinases associées La réponse génique secondaire Les composants essentiels de la réponse secondaire sont représentés par les gènes: p53, mdm2, waf-1(p21) les cyclines A, B1, D1, D3 et E, et la cycline kinase-dépendante 1

42 La réponse génique secondaire Tous ces gènes subissent une augmentation de leur expression entre la 8 e et la 24 e h après hépatectomie partielle, alors que le premier pic de synthèse de l’ADN survient à 24 heures. prévention d’une éventuelle dérégulation des activateurs du cycle cellulaire soit activateurs soit inhibiteurs Ces gènes sont du cycle cellulaire

43 2 eme étape

44 Déclenchement de la régénération hépatique expression ou activation d’un facteur de croissance HGF ? = facteur mitogène  dans sang après hépatectomie partielle EGF ? semble nécessaire à la régénération hépatique synthétisé par les hépatocytes pendant un bref intervalle de temps après hépatectomie partielle Des précurseurs des facteurs de croissance, ancrés à la membrane ¢, sont activés en début de régénération hépatique et pourraient avoir un effet localisé grâce à leur attachement à la surface cellulaire

45 HGF TGF  Facteurs de croissance Hépatocytes en culture + Hépatocytes quiescents du foie in vivo ø Hépatocytes après hépatectomie partielle + NF-kB, STAT3, AP1

46 Les facteurs de croissance HGF  glycoprotéine avec une chaîne lourde et une chaîne légère  = plus puissant mitogène hépatique  synthétisé par ¢ stellaires (Ito), ¢ Kupffer et ¢ endothéliales (pas hépatocytes) Hépatectomie partielle:  activité protéasique  ? conversion HGF inactif en facteur actif  présente dans le sang circulant sous forme de précurseur inactif

47  après hépatectomie partielle: taux sérique  à la 1ére h et reste élevé pendant 4 à 6 heures  HGF pourrait agir sur les hépatocytes par mécanisme endocrine (sang circulant) et sur les ¢ hépatiques non parenchymateuses par mécanisme paracrine  hépatite fulminante  taux sanguin d’HGF le plus élevé  taux d’HGF pourrait servir au pronostic car corrélation inverse entre les taux circulants d’HGF et la survie ARNm  dans le foie à des temps plus tardifs et pic 18 à 24 h HGF

48 TGF   L’expression hépatique de TGF-  est transitoire et revient à la normale après l’arrêt de la croissance hépatique.  L’expression du TGF-  est élevée au cours de la période néonatale et très basse dans le foie adulte  Taux sériques circulants de TGF-  corrélés à l’importance de la régénération  hépatectomie partielle :  ARNm à partir de la 4 e heure, maximum avant pic de synthèse de l’ADN  taux de TGF-  circulant 24 à 48 h après hépatectomie

49 EGF  Ni le foie fœtal, ni adulte ne produisent ce facteur ?  Pas décelable dans le sang portal chez les rats normaux ou partiellement hépatectomisés  Mais une seule injection d’EGF dans la veine porte  une  de l’ARNm du récepteur de l’EGF (EGFR) et une  de l’activité EGF-liante pendant 1 à 3 h, reproduisant les événements observés brièvement après hépatectomie partielle

50 EGF-Récepteur  Se lie avec EGF et TGF  (rivalité) EGF se lie avec 4 à 5 fois plus d’affinité TGF   + grande stimulation de la synthèse d’ADN  Après hépatectomie partielle: l’affinité de liaison au récepteur pour les deux ligands ne change pas le nombre de récepteurs présents dans les membranes d’hépatocyte varie de façon bi-phasique:  x 2 après 3 h avec  ARNm de EGFR  forte  du nombre des récepteurs jusqu’à 72 h après l’opération (  de 50% ARNm de EGFR)

51 Expression des ARNm d’EGFR et TGF  après hépatectomie partielle Quantité (% du contrôle) Heures après hépatectomie partielle

52 Accélérateur de la régénération hépatique (ARH)  peptide cytosolique dont le gène est localisé sur le chromosome 16  pas d’activité mitogénique sur le foie normal, mais stimule la synthèse d’ADN après hépatectomie  l’ARNm de l'ARH n’  pas après hepatectomie partielle, donc la source de l’ARH circulant reste à établir

53 3 eme étape

54 Après hépatectomie partielle, la régénération survient en deux grandes vagues de prolifération ¢:  Une première vague, avec un pic de réplication de l'ADN à 24 h suivi d'un taux maximal de mitoses à 30 h qui concerne principalement des hépatocytes.  Une seconde vague, intéressant tous les types cellulaires du foie, survient après 30 h et se poursuit sur 3 à 5 jours. SYNTHESE D’ADN

55 Rôle de l’EGF sur la réplication de l’ADN dans les hépatocytes en culture En absence de facteur de croissance, les hépatocytes ne répliquent pas leur ADN En présence de facteur de croissance, une forte réplication objectivée par l'incorporation de thymidine tritiée temps de culture (h)

56 Autres Facteurs et Adjuvants Substances stimulatrices HBGF-1 pourrait agir comme signal précoce pour l’activation des étapes initiales de la synthèse de DNA HBGF-1 pourrait contribuer à la fin de la réplication hépatocytaire par liaison à des récepteurs spécifiques et plus tard,

57 Autres Facteurs et Adjuvants Substances stimulatrices  Les plus importantes: insuline, glucagon, nor adrénaline  L’insuline et le glucagon agissent en synergie avec EGF pour améliorer ses effets sur les hépatocytes  L’insuline a aussi un effet général trophique sur le foie  nor adrénaline, PGE2, et PGE2a = adjuvants pour la prolifération des hépatocytes  La noradrénaline, agissant sur les  1-récepteurs:  activités mitogéniques de EGF et HGF  noradrénaline et l’adrénaline  dans le sang brièvement après hépatectomie partielle

58 Autres Facteurs et Adjuvants Substances stimulatrices  hormone de croissance et hormone parathyroïde: effets « permissifs » ou déclenchants sur la régénération  Des injections d’hormone de croissance  la synthèse ADN après hépatectomie partielle  Après hypophysectomie, la régénération est bcp + lente, retard d’  24h  Les œstrogènes peuvent aussi influencer la régénération hépatique et améliorent l’effet mitogénique de EGF

59 Autres Facteurs et Adjuvants TGF  s comme inhibiteur de la synthèse de l’ADN de l’hépatocyte  régulateurs multifonctionnels: facteurs polypeptides qui agissent dans  tous les types ¢  Trois isoformes dans le foie : TGF  1, TGF  2 et TGF  3 [TGF  1] dans le foie normal ou régénérant est  10 fois plus importante que celle des autres isoformes  Au cours de la régénération: mRNA TGF  1  à 4 heures et reste élevé pendant 72 à 96 h mRNA TGF  2  entre 2 et 4 heures et puis  mRNA TGF  3 a une  aiguë à 2 et 4 h et a une expression basse après

60 Autres Facteurs et Adjuvants  RNAs localisés exclusivement dans ¢ non parenchymateuses, pas dans les hépatocytes les hépatocytes peuvent contenir le peptide mais ne le synthétisent pas dans le foie normal ou en régénération  = inhibiteurs potentiel de la synthèse de DNA pour les hépatocytes  Administration de TGF  1: inhibition de la 1 ére vague de synthèse d’ADN dans la régénération du foie

61 IL6 TGF  HGF Rôles des cellules non parenchymateuses TNF 

62 Formation des sinusoïdes restauration de l’architecture normale  après hépatectomie partielle = complète restauration du parenchyme  la charpente de réticuline du foie reste intacte  la prolifération des cellules parenchymateuses et non parenchymateuses procède d’une façon ordonnée, et le rapport correct entre cellules et matrices est maintenu (à la fin)

63 Formation des sinusoïdes restauration de l’architecture normale  les hépatocytes se reproduisent d’abord  les mRNAs de fibronectine, vitronectine, laminine B1 et collagène type I et III , environ 4 h après hépatectomie partielle et soit reviennent à la normale durant le premier jour soit restent élevés pendant 24 à 48 h  Pendant les 2 premiers jours : le rapport matrice extracellulaire/cellule   les hépatocytes nouvellement produits forment des groupes qui ne contiennent pas de sinusoïdes  il y a d’abord croissance de la masse cellulaire (prolifération des hépatocytes) sans croissance correspondante de la matrice

64  La coordination entre la prolifération ¢ et le dépôt de la matrice dépend de signaux produits par les ¢ parenchymateuses et non parenchymateuses, médiés par des facteurs diffusibles (?) Formation des sinusoïdes restauration de l’architecture normale  C’est seulement  6 jours après l’opération que les sinusoïdes se forment entre les hépatocytes, restaurant l’architecture normale des couches cellulaires  Aucune mb. basale, à aucune étape de la régénération

65

66 Hépatectomie partielle Évènements rapides entraînant des modification des facteurs de transcription et une augmentation de la liaison à l’ADN (NF  B, PHF) Stress oxydatif ? Cytokines ? Variations ioniques ? Variations métaboliques ? Synthèse d’ADN PROGRESSIONPROGRESSION Progression G 1 Transition G 1 /S Régulation de la phase G 1 Cycline E Cycline A expression de p53 expression de ras TGF  ? I N I T I A T I O N 1 à 4 h Réponse primaire des gènes (c-fos, c-jun, c-myc …)  Production des facteurs de transcription Propagation de la réponse primitive et activation de la réponse secondaire Transition G 0 /G 1 Régulation des facteurs de croissance HGF TGF  EGF TGF  Inhibi- tion

67 Hépatectomie partielle Apparition d’un signal rapide Modification de NF  B, STAT3 et autres facteurs Réponse des gènes primaires Réponse des gènes secondaires Progression du cycle cellulaire RLO TNF cytokines

68 La capacité régénérative du foie est connue depuis l'antiquité. Dans la mythologie grecque, pour punir Prométhée d'avoir donné le feu aux hommes, Zeus le fit enchaîner, nu, à une colonne dans les montagnes du Caucase où un vautour lui dévorait le foie durant le jour. Il n'y avait pas de fin à son supplice car toutes les nuits, son foie se reconstituait.