CHOC OXYDANT ET PROTISTES PATHOGENES Helene YERA, MCU-PH Parasitologie Mycologie, Faculté de Médecine, Paris Descartes, GHU Cochin, Hôtel-Dieu, Broca, APHP Biologie cellulaire comparative des Apicomplexes, Institut Cochin, INSERM U1016, CNRS UMR 8104, MP5

LES PROTISTES 1886 : Ernst Haeckel crée un règne spécial, les protistes, réunissant tous les êtres vivants unicellulaires. 3 ensembles : les protistes à affinités végétales, ou protophytes, les protistes à affinités avec les champignons, ou protomycètes (mycétozoaires) les protistes à affinités animales, ou protozoaires

LES PROTISTES PATHOGENES SANTE PUBLIQUE HUMAINE Population concernée Amibes : Entamoeba histolytica Amibiase plusieurs dizaines de M Acanthamoeba Kératites , GAE quelques dizaines de M Flagellés : Giardia Diarrhées plusieurs dizaines de M Trichomonas vaginalis Trichomoniase plusieurs centaines de M Kinétoplastidés : Trypanosoma gambiense Maladie du sommeil centaine de M T. rhodesiense Trypanosoma cruzi Maladie de Chagas centaine de M Leishmania Leishmanioses plusieurs dizaines de M Apicomplexa : Toxoplasma gondii Toxoplasmose ? Plasmodium Paludisme 5-700 M Protistes opportunistes émergeant avec l’immunodépression : Microsporidies, Cryptosporidium etc... quelques milliers de cas

LES PROTISTES PATHOGENES IMPACT ECONOMIQUE Trypanosoma brucei élevage des bovins Eimeria et Toxoplasma (coccidies) lapins, volailles, ovins Babesia et Theleria (coccidies sanguins) bovins, équins, canins Perkinsus (algue microscopique) huîtres Tritrichomonas fœtus bovins Balantidium porcs Microsporidies, Myxosporidies, Actinomyxidies poissons

LES PROTISTES PATHOGENES DES MOYENS DE LUTTE LIMITES, INADAPTES OU INEFFICACES VACCINATION IMPOSSIBLE OU TRES DIFFICILE DANS BEAUCOUP DE CAS Paludisme MEDICAMENTS INADAPTES CAR TROP CHERS Eflornithine dans le cas de la maladie du sommeil MEDICAMENTS INADAPTES CAR TROP TOXIQUES Nifurtimox et antimoniaux contre trypanosomes et leishmanies MEDICAMENTS PEU EFFICACES Maladie de Chagas, Maladie du sommeil, infections à Acanthamoeba DEVELOPPEMENT DE LA RESISTANCE Paludisme, Leishmaniose, Giardiase etc...

LES PROTISTES PATHOGENES TROUVER DE NOUVELLES ARMES VACCINATION Semble très difficile à mettre au point dans de nombreux cas. Seule solution à long terme AMELIORER DES MEDICAMENTS EXISTANTS Voie très utilisée. Résultats aléatoires ASSOCIATION DE MEDICAMENTS EXISTANTS Bithérapie (Paludisme, Maladie du sommeil) TROUVER DE NOUVELLES MOLECULES PAR CRIBLAGE A HAUT DEBIT Très employée actuellement. Limitée par la lourdeur des tests directs sur les parasites RECHERCHER DES CIBLES SPECIFIQUES AU PARASITE Voies métaboliques spécifiques Cibles différant suffisamment de celles existant chez l’homme Bien adaptée au criblage à haut débit de banques chimiques LA DEFENSE CONTRE LE CHOC OXYDANT OUVRE DE NOUVELLES VOIES DE RECHERCHE

CHOC OXYDANT ET PROTISTES PATHOGENES

CHOC OXYDANT ET ORGANISMES PATHOGENES Les organismes pathogènes sont exposés à un choc oxydant de plusieurs origines : - Niche écologique dans leur hôte et variation au cours du cycle biologique - Métabolisme propre des organismes pathogènes - Réponse immune de l’hôte - Médicaments

Bactéries et champignons MILIEU DE VIE ET OXYGENE MILIEU INTRACELLULAIRE PLASMA HEMATIES EPITHELIUM ALVEOLAIRE COLON TENSION EN OXYGENE E. histolytica Giardia Cryptosporidium Bactéries et champignons Anaérobies strictes Leishmania Toxoplasma Brucella Bordetella Yersinia P. carinii T. gambiense Plasmodium Microorganismes des septicémies

METABOLISME ET CHOC OXYDATIF Monoamine oxydase Cytochrome oxydase Xanthine oxydase Aldéhyde oxydase Glucose oxydase Oxydases à FAD D aminoacide oxydase Glycolate oxydase Urate oxydase NADPH oxydase NADH déshydrogénase Succinate déshydrogénase Flavines déshydrogénases Dihydroorotate déshydrogénase Cytochrome P450 Cytochrome b5 Ferredoxines NO synthase (NOs) Ribonucléotide réductase Mitochondrie Lysosome peroxysome Nox Cytoplasme NOs Noyau Eucaryote Procaryote ESPACE PERIPLASMIQUE PAROI

REPONSE IMMUNE DE L’HOTE ET CHOC OXYDATIF Polynucléaires neutrophiles Nox MPO Cl- H2O2 O2.- iNOs NO. ONOO- HClO MPO : MyéloPerOxydase iNOs : NO synthase inductible Espèces Activées de l’ O2 (EAO) O2 °- : anion superoxyde H2O2 : peroxyde d’hydrogène HClO : hypochlorite Espèces Activées de l’ N (EAA) Nox : oxydes d’azote NO° : monoxyde d’azote ONOO- : peroxynitrite iNOs P,B,C Nox NO. O2.- ONOO- H2O2 Plasmodium (P) Bactéries (B) Champignons (C) Entamoeba (P)

Bactérie phagocytée (B) REPONSE IMMUNE DE L’HOTE ET CHOC OXYDATIF Macrophage Nox iNOs O2.- NO. iNOs : NO synthase inductible Espèces Activées de l’ O2 (EAO) O2 °- : anion superoxyde H2O2 : peroxyde d’hydrogène Espèces Activées de l’ N (EAA) Nox : oxydes d’azote NO° : monoxyde d’azote ONOO- : peroxynitrite ONOO- Leishmania (P) Bactérie phagocytée (B)

ORIGINE EXTERNE ORIGINE INTERNE LE STRESS OXYDANT CHEZ PLASMODIUM ORIGINE EXTERNE ORIGINE INTERNE ENZYMES SPECIFIQUES Dihydroorotate déshydrogénase Cyt P 450 N M IMMUNITE CELLULAIRE NON SPECIFIQUE DIGESTION DE L'HEMOGLOBINE AUTO-OXYDATION DE L'HEMOGLOBINE DESTRUCTION DES DEFENSES ANTIOXYDANTES DE L'HEMATIE HEMOGLOBINOPATHIES MEDICAMENTS : ENDOPEROXYDES

LES DEFENSES ANTIOXYDANTES OXYGENE SINGULET (O2°) RADICAL HYDROXYL (OH°) Glutathion (GS) Trypanothion Ascorbate -Tocophérol Caroténoïdes Métallothionéines Acide urique Bilirubine Spermine ANION SUPEROXYDE (O2°-) Superoxyde dismutase (SOD) Superoxyde réductase (SOR) PEROXYDE D’HYDROGENE HYDROPEROXYDES LIPIDIQUES (H202) (ROOH) Catalase (CAT) Se-Glutathion peroxydase/GSH/Glutathion réductase Phospholipide hydroperoxy glutathion peroxydase/GSH/Glutathion réductase Peroxyrédoxine/thiorédoxine/thiorédoxine réductase Arylhydroperoxy réductase (AHR) Ascorbate peroxydase

LES DEFENSES ANTIOXYDANTES CHEZ LES BACTERIES ANION SUPEROXYDE (O2°-) Superoxyde dismutase (SOD) LA PLUPART DES BACTERIES SOUVENT 3 TYPES Superoxyde réductase (SOR) Treponema pallidum ESPACE PERIPLASMIQUE PAROI MnSOD FeSOD SOR CAT GSPx AHR Cu-Zn SOD PEROXYDE D’HYDROGENE (H202) HYDROPEROXYDES LIPIDIQUES (ROOH) Catalase (CAT) Se-Glutathion peroxydase (GSpx)/GSH/Glutathion réductase Arylhydroperoxy réductase (AHR) Peroxyredoxine/thioredoxine/thioredoxine réductase

Respiration mitochondriale DEFENSES ANTIOXYDANTES CONNUES CHEZ LES PROTISTES PATHOGENES Microaérophiles Respiration mitochondriale Entamoeba Superoxyde dismutase (1) Arylhydroperoxy -réductase Cystéine Trichomonas Superoxyde dismutase (?) Cystéine THIOREDOXINE Thioredoxine réductase PEROXYREDOXINE Toxoplasma Superoxyde dismutase (3) Catalase GLUTATHION Glutathion Réductase THIOREDOXINE PEROXYREDOXINE Acanthamoeba Superoxyde dismutase (2) Catalase GLUTATHION Glutathion Peroxydase Glutathion réductase Glutathion transférase Plasmodium Superoxyde dismutase (2) Kinétoplastidés (Trypanosomes) Superoxyde dismutase (3) GLUTATHION Glutathion Réductase transférase THIOREDOXINE Thioredoxine réductase PEROXYREDOXINE Peroxydases GSH TRYPANOTHION Trypanothion réductase Tryparedoxine Tryparedoxine peroxydase THIOREDOXINE Ascorbate peroxydase

DEFENSES ANTIOXYDANTES CONNUES CHEZ LES PROTISTES PATHOGENES SYSTEMES NON ENZYMATIQUES ET ENZYMES DE REGENERATION Trypanothion (spécifique des kinétoplastidés) Trypanothion réductase (spécifique des kinétoplastidés) Glutathion Glutathion synthase / Glutathion réductase (Trypanosoma brucei) Glutathion transférase / Glutathion réductase (Plasmodium) Thioredoxine (Plasmodium, Trypanosoma brucei, Toxoplasma) Thioredoxine réductase / Plasmoredoxine (Plasmodium) ENZYMES DE REPARATION DES LESIONS OXYDATIVES Enzymes d’excision et de réparation de l’ADN (connues chez Plasmodium) ENZYMES FOURNISSEURS DE NADPH Glutamate déshydrogénase (Plasmodium) Isocitrate déshydrogénase à NADP (Plasmodium)

Stress oxydant endogène chez Plasmodium : importation de l’hémoglobine & respiration mitochondriale (1,2) Dans la vacuole digestive, l’auto-oxydation de l’hémoglobine libère O2°− et produit de l’hématine (FP IX). mitochondrie vacuole digestive MP: Membrane du Parasite MVP: Membrane de la Vacuole Parasitophore Hz : Hémozoïne Patzewitz et al. 2012 Mol Microbiol (3) Les superoxydes dismutases à Fer détoxifient O2°− en H202 : dans le cytoplasme (FeSOD1), dans la mitochondrie (FeSOD2). (4) Réaction de Fenton : H202 réagit avec O2°− en présence de Fer (Fe2+) pour donner le radical hydroxyl OH° espèce activée de l’oxygène très nocive. (5) Détoxification de H202 en H20 : réduction par les systèmes Glutathion, Thioredoxine ou Peroxyredoxines.

DEFENSE CONTRE LE CHOC OXYDANT ET CIBLAGE THERAPEUTIQUE CHEZ LES PROTISTES PATHOGENES

BIEN CONNAÎTRE LA CIBLE POUR POUVOIR L’INHIBER - le problème de la validation comme cible Le problème du knock out, k.o. (inactivation de gène) létal Stratégies alternatives (ARNt interférent, ARNm antisens, inhibition par compétition d’un dominant négatif) - Le polymorphisme naturel peut il affecter des régions critiques pour le ciblage ? - Bien caractériser l ’enzyme sur le plan biochimique et structural Le site actif et son environnement Le canal d’accès au substrat L ’interface monomère-monomère Le design d’inhibiteurs potentiels - Les conditions requises pour réaliser des criblages Production d’une protéine recombinante de bonne qualité Un test miniaturisé adaptable à haut débit Des méthodes confirmatives Une vérification sur l’organisme cible

LES ENZYMES ANTIOXIDANTES VALIDEES CHEZ LES PROTISTES PARASITES ENZYME ESSENTIELLE TRYPANOTHION REDUCTASE GLUTATHION REDUCTASE 2-Cys PERIREDOXIN THIOREDOXINE REDUCTASE SUPEROXYDE DISMUTASE PARASITE T. cruzi Plasmodium Toxoplasma T. brucei METHODE Génétique réverse (k.o.) Inhibiteurs Génétique réverse (RNAi) Génétique réverse (k.o., anti mRNA)

MOLECULES OXYDANTES OU INHIBITRICES DE SYSTEMES ANTIOXYDANTS VALIDEES Eflornithine Nifurtimox Artémisinine Primaquine Dérivés imidazolés PARASITE Trypanosomes Trypanosoma cruzi Plasmodium Leishmania MECANISME D’ACTION Inhibe la synthèse du trypanothion Production d’anion superoxyde (O2°-) Alkylation radicalaire des protéines (R°) Production d’ E.A.O. Inhibe la superoxyde dismutase Sánchez-Moreno et al. 2015 Parasitology

LES SUPEROXYDE DISMUTASES CIBLES MEDICAMENTEUSES POTENTIELLES EXEMPLE DE PLASMODIUM

SUPEROXYDE DISMUTASE Catalyse la dismutation de l’anion superoxyde en peroxyde d’hydrogène O2°-  H2O2 Phylogéniquement séparées en quatre familles distinctes MnSOD & FeSOD tétramériques Métazoaires, Fungi, Plantes, Protistes (Tetrahymena), Bactéries Gram+ à bas et haut G+C Archébacteries MnSOD dimériques Protistes (Chlamydomonas) Bacteries Gram+ à bas G+C Protéobactéries FeSOD dimériques Plantes, Protistes (Apicomplexa, Entamoeba, Kinétoplastidés, Parabasala) Protéobactéries Cu / Zn SODs Bactéries Eucaryotes (mammifères) Protistes (Tetrahymena, Eimeria) Wintjens et al. 2004 J Biol Chem

POUR CONTRE LA SUPEROXYDE DISMUTASE A FER DES PROTISTES PEUT- ELLE CONSTITUER UNE CIBLE POTENTIELLE ? POUR - SEULE ENZYME CAPABLE D’ELIMINER O2°- CHEZ LES PROTISTES ROLE ESSENTIEL DANS LA PROTECTION CONTRE LE PEROXYNITRITE ONOO- RESULTANT DE LA REACTION ENTRE O2°- et NO° - CHEZ TOUS LES PROTISTES PATHOGENES SAUF GIARDIA - LA SOD DES PROTISTES PATHOGENES DIFFERE FONDAMENTALEMENT DE CELLES CONNUES CHEZ L’HOMME CONTRE - DIFFICILE A VALIDER SI ELLE EST INDISPENSABLE (K.O. LETAL) - SUBSTRAT DE PETITE TAILLE (O2-°), DONC DIFFICULTE DE TROUVER DES INHIBITEURS CALQUES SUR LUI

LA SOD DES PROTISTES PATHOGENES DIFFERE DE CELLES CONNUES CHEZ L’HOMME Cu/Zn SOD humaine Mn SOD humaine tétramérique FeSOD protistes dimérique Structures de base de la FeSOD des protistes et de la MnSOD mitochondriale humaine proches ; mais structures quaternaires (dimère au lieu de tétramère), sensibilité aux inhibiteurs classiques (en particulier H2O2) liée au métal cofacteur (Fe dans les SOD de protistes) diffèrent.  On peut donc espérer trouver des inhibiteurs spécifiques des FeSOD.

LES INHIBITEURS DE PfSODs COMME ANTIPALUDEENS ?

Screening Confirmation Banque 1 1120 tripeptides Banque 2 SCREENING DE BANQUES CHIMIQUES POUR LA RECHERCHE D’INHIBITEURS DE PfSOD1 Screening Confirmation Hits 1 Hits 2 Test activité SOD microplaque Méthode PMS/NADH /NBT Test activité SOD spectrophotométrie Méthode PMS/NADH /NBT Méthode au Pyrogallol Banque 1 1120 tripeptides Banque 2 1696 composés différents Banque 3 4096 tripeptides 49 209 15 En cours Soulère et al. 2003 Bioorg Med Chem

INHIBITEURS DE PfSOD1 chalcones Dérivés de la piperazine Autres composés Pas de relation entre l’action inhibitrice sur la SOD parasitaire et l’activité antipaludique des produits testés in vitro. Ce résultat peut être du à : des difficultés de pénétration des molécules actives dans les hématies parasitées ou une activité autre Soulère et al. 2003 Bioorg Med Chem

CONCLUSIONS MECANISMES D’ACTION D’ANTIPARASITAIRES CHOC OXYDANT INHIBITION DE SYSTÈME ANTIOXYDANT

CHOC OXYDANT ET PROTISTES PATHOGENES Helene YERA, MCU-PH Parasitologie Mycologie, Faculté de Médecine, Paris Descartes, GHU Cochin, Hôtel-Dieu, Broca, APHP Biologie cellulaire comparative des Apicomplexes, Institut Cochin, INSERM U1016, CNRS UMR 8104, MP5

ENZYMES ANTIOXYDANTES ET PATHOGENESE CHEZ LES BACTERIES CuZnSOD périplasmique bactérienne Niveau d’expression impliquée dans la virulence chez: E. coli, Helicobacter pylori, Salmonella typhimurium Shigella flexneri Listeria monocytogenes Des souris vaccinées avec la CuZnSOD de Brucella abortus sont protégées contre l’infection. La fixation d’anticorps anti CuZnSOD accélère l’élimination de Nocardia asteroides dans les poumons et le foie des souris infectées par rapport à des anticorps non spécifiques MnSOD secrétée chez les Mycobactéries Le niveau relatif d’expression est en relation avec la virulence Mycobacterium smegmatis : 1 Mycobacterium avium : 10 M. tuberculosis : 300

DIFFERENTS MECANISMES D’ECHAPPEMENT Macrophage Neutrophile Nox iNOs O2- NO. ONOO- Protéines cytotoxiques inhibition de la phagocytose. Secrétion d’une capsule Antiphagocytaire Clostridium septicum Neisseria Staphylococcus aureus Streptococcus pneumoniae Streptococcus A Cryptococcus neoformans Echappement du phagosome vers le cytoplasme Nox non assemblée L. monocytogenes Shigella Rickettsia Inhibition de l’assemblement de la Nox. Leishmania donovani Legionella pneumophila Plasmodium falciparum Superoxyde dismutases périplasmiques Protègent contre O2- E. coli, Helicobacter pylori, Salmonella typhimurium Shigella flexneri Listeria monocytogenes Enzymes de réparation de l’ADN Enzymes antioxydantes Piégeurs de radicaux Inhibition du trafic des vésicules contenant la Nox vers le phagosome Protéine SP12 Signalisation nouvelle pour la phagocytose Helicobacter pylori Perturbation de la formation du phagosome Perturbation du trafic de la Nox du phagosome vers la membrane cellulaire

MOLECULES OXYDANTES OU INHIBITRICES DE SYSTEMES ANTIOXYDANTS EN COURS D’ETUDE MOLECULES -Phénothiazines -Acridines tricycliques -Dérives de la polyamine et de la spermidine Bases de Mannich Bleu de méthylène PARASITE Trypanosomes Plasmodium MECANISME D’ACTION Inhibent la trypanothion réductase Inhibent la thioredoxine Inhibe la glutathion

CONCEPTION MOLECULAIRE PAR DOCKING D.Dive : Choc oxydant et protistes pathogènes Inserm U547 et Institut Pasteur de Lille

INHIBITEURS PROPOSES PAR CONCEPTION RAISONNEE Des inhibiteurs basés sur la structure moléculaire des SOD à fer de T. cruzi et de P. falciparum ont été conçus et synthétisés. In vitro, aucune de ces molécules n’inhibe l’activité des SODs recombinantes.