UE2 – ingénierie du médicament – Sciences galénique et physicochimiques ED3 Chimie analytique Méthodes de couplage

Exercice I Séparation du gaiacol et du vératrol par CG a- Phase stationnaire de type Carbowax: Tube en métal ou en verre rempli d’un granulé poreux imprégné de polyéthylène glycol Liquide inerte, stable et non volatil (dans les conditions de l’analyse) Propriété de solvant vis-à-vis des molécules à analyser (solutés) Phase stationnaire polaire

GaiacolVératrol b- Les températures d’ébullition des deux composés sont trop proches pour prévoir l’ordre d’élution en ne considérant que leur volatilité. Dans une colonne polaire, des interactions supplémentaires, comme les liaisons hydrogènes, s’ajoutent à celles qui existent en grand nombre dans une colonne apolaire, et s’établissent entre les solutés et la phase stationnaire entrainant une rétention différente pour les solutés. Sur phase stationnaire polyéthylène glycol: Rétention Gaiacol > Rétention Vératrol  Tr Gaiacol (Tr G ) > Tr Vératrol (Tr V )

Exercice II a- Séparation des hydrocarbures poly aromatiques par CG sur colonne moyennement polaire DB5: Phase stationnaire peu polaire : méthylphényl siloxane La rétention augmente avec le nombre de carbones sp 2, par interactions de type dipôle-dipôle induit. Couple critique : anthracène/phénanthrène Tr = 6 min Tr = 10 min Tr = 12,45 min Tr = 20 min Tr = 13 min

Les composés font partie d’une série homologue d’hydrocarbures aromatiques. D’après Kovats, dans une série homologue, la rétention des composés augmente en fonction du nombre de carbone dans la molécule comme ci-après: log Vg = a.n C + b avec n C : nombre de carbone dans la molécule Vg: volume de rétention spécifique du soluté Volume de rétention spécifique Vg : Vg = A.Vr’ / T°c log Vg = [  H / (2,3.R.T°c)] + cte  H : enthalpie de dissolution ou d’adsorption du soluté T°c : température de la colonne analytique A : coefficient Vr’ : Volume de rétention réduit avec Vr’ = Vr – Vo = D. Tr’ Tr’ : Temps de rétention réduit avec Tr’ = Tr – To Vo : Volume mort To : Temps mort Vr: volume de rétention Tr: Temps de rétention D: débit de la phase mobile n C Benzo(a)Pyrène > n C Anth et Phénanth > n C Fluorène > n C Naphtalène Donc:Tr Benzo(a)Pyrène > Tr Anthracène et Tr Phénanthrène > Tr Fluorène > Tr Naphtalène

b- Influence de l’épaisseur du film de la phase stationnaire (e f ): efef dCdC  = d C / (4.e f )  plus e f ↗ et plus  ↘ Comme: K = . k’  k’ = K /  donc plus e f ↗ et plus k’ ↗ Augmentation de l’épaisseur de la phase stationnaire peut provoquer:  une augmentation de la somme des interactions soluté-phase stationnaire qui entraine une augmente de sa rétention sur la colonne;  une augmentation de la sélectivité entre 2 pics, qui dépend de la différence de la somme des interactions établies entre chacune des deux substances et la phase stationnaire..

Exercice III Séparation des hydrocarbures aliphatiques linéaires, par CG – FID en fonction de deux conditions de température sur colonne apolaire DB1: Méthylsilicone Analyses en mode isotherme Après injection, les constituants du mélange injecté sont portés à l’état vapeur et entraînés par le gaz vecteur en tête de colonne. Le gaz vecteur a pour rôle de transporter les analytes qui sont élués les uns après les autres en fonction de leur température d’ébullition et de leur plus ou moins grande affinité vis-à-vis de la phase stationnaire, par dissolution (CG liquide/gaz) ou par adsorption (GC solide/gaz). Pour des composés appartenant à une même série homologue, leur rétention croît en fonction du nombre de carbone dans leur formule brute. Plus l’énergie fournie est proche de l’enthalpie de désolvatation du soluté ou de désorption, plus les équilibres L/G ou S/G sont en faveur de la phase gazeuse, et plus vite, le soluté est Élué.

a- Elution en fonction de T° ébullition des composés A Température de colonne fixe: Le composé le plus volatil aura la température d’ébullition T° ébullition la plus faible ou la pression de vapeur Pi la plus élevée:  K faible et comme: K = . k’  k’ = K /  donc k’ faible et ce composé sera le moins retenu Partage du composé i entre: - phase stationnaire = polymère liquide - phase mobile gazeuse: (rôle de phase mobile: transporter l’analyte sous forme vapeur jusqu’au détecteur Ci stat ⇄ Ci mobile K = Ci stat / Ci mobile = Ci stat / Pi Pi: pression partielle du composé i qui est fonction de sa pression de vapeur Séparation des analytes: - 1 er en fonction de leur T° d’ébullition ou Pi pression de vapeur - 2 cd en fonction de leur plus ou moins grande interaction avec phase stationnaire (tenir compte des log P)

b- Le temps de rétention augmente avec la température d’ébullition des solutés présents dans la phase stationnaire. Les composés font partie d’une série homologue d’hydrocarbures aliphatiques. D’après Kovats, dans une série homologue, la rétention des composés augmente en fonction du nombre de carbone dans la molécule comme ci-après: log Vg = a.n C + b avec n C : nombre de carbone dans la molécule Vg: volume de rétention spécifique du soluté Volume de rétention spécifique Vg : Vg = A.Vr’ / T°c log Vg = [  H / (2,3.R.T°c)] + cte  H : enthalpie de dissolution ou d’adsorption du soluté T°c : température de la colonne analytique A : coefficient Vr’ : Volume de rétention réduit avec Vr’ = Vr – Vo = D. tr’ Vo : Volume mort Vr: volume de rétention Vr’ = D. tr’ D: débit de la phase mobile n C Undécane > n C Décane > n C Nonane > n C Octane Donc:Tr Undécane > Tr Décane > Tr Nonane > Tr Octane

c- Calcul de la résolution entre deux pics a et b: Rs (T C ° = 140°C) Rs (T C ° = 200°C) Nonane - octane2,50,6 Décane - Nonane3,51,5 Undécane - Décane4,50,5 Une meilleure séparation est obtenue avec une analyse à 140 °C en mode isotherme car Rs > 1,5.

 Ionisation par impact électronique en mode positif (EI+): Injecteur 250°C Colonne capillaire Interface Source d’ions Filament Lentilles de focalisation Quadripôle Détecteur CPG Séparation X Y Z Ionisation et Détection X +. Y +. Z +. On obtient les Temps de rétention Sous les tr des différents analytes, on voit leur Spectre de masse Couplage de la chromatographie en phase gazeuse avec la spectrométrie de masse: X + e  X e Pics Moléculaires CPG SM X X+.X+. X  Ionisation par ionisation chimique en mode positif (IC+): X + H +  XH + MH + = Pic quasi-moléculaire visible à: M/z +1 = M+1 pour ion monochargé (z = 1)

b- En couplage GC/MS, le mode d’ionisation utilisé est l’impact électronique en mode positif (IE+): un électron est arraché à la molécule, il se forme un radical cation nommé ion moléculaire et noté M + ° Sur le chromatogramme, sous le pic chromatographique au temps de rétention 20 min, apparait un spectre de masse avec un pic de rapport masse sur charge m/z = 252. Cette valeur correspond à la masse molaire du B(a)P donc ce pic correspond au pic moléculaire. On peut affirmer que le B(a)P présente un temps de rétention de 20 min. Pour le B(a)P* marqué, le pic moléculaire a un rapport m/z = 254. c- Etant donné du faible nombre d’atomes de H remplacés par des atomes de D (2 H par 2 D), le comportement physico-chimique du B(a)P marqué et non marqué est semblable et leur rétention sera la même vis-à-vis du système chromatographique. On considèrera les T° d’ébullition, les solubilités et les interactions en SPE et en chromatographie des 2 composés, marqué et non marqué, identiques: Temps de rétention du B(a)P* marqué = 20 min Exercice IV a- MM B(a)P = 20x = 252 MM B(a)P* marqué = 20x = 254

d- Intérêt de traiter les échantillons à doser et les solutions étalons de la même façon pour: - reproduire les mêmes erreurs relatives - réduire les biais aléatoires et systématiques Rôle de l’étalon interne (EI): S’il est judicieusement choisi (comportement proche de celui des analytes vis-à-vis des différentes étapes de traitement de l’échantillon(SPE, dérivation, injection,…)): - pondère les fluctuations - permet de s’affranchir des variations pour le calcul de la concentration e- Concentration en B(a)P dans les prélèvements aqueux: Etalonnage interne: On calcule le rapport (R) des aires sous courbe chromatographique du B(a)P non marquée et du B(a)P* marquée pour chacune des concentrations de la gamme d’étalonnage et pour la solution inconnue. Puis, on porte ce rapport R en fonction de la concentration en B(a)P avant extraction et dilution des solutions de la gamme d’étalonnage

A B(a)P A B(a)P* RC (mol/L) ,330, ,670, ,370, ,890, ,690, ,70Solution inconnue R [B(a)P] (mol.L -1 ) [B(a)P] inconnue = 0,715 mmol.L -1 A l’aide de l’équation de la droite d’étalonnage, on en déduit la concentration: Etalonnage interne Concentration de B(a)P dans les 2 mL d’échantillon aqueux

f- concentration de B(a)P dans les prélèvements aqueux si les échantillons de la gamme étalon sont dilués, comme les inconnus, mais n’ont pas subi l’étape d’extraction sur SPE: On doit effectuer un étalonnage externe car on ne peut plus tenir compte de l’étalon interne car sa concentration est différente dans les étalons et inconnu. Après dépôt sur SPE de 50 mL de l’inconnu dilué et recueil de 5 mL d’éluat, le rendement d’extraction sur SPE étant de 65%, on peut calculer la concentration du [B(a)P]: [B(a)P] = C inconnu x 5/50 / Rendement SPE [B(a)P] = C inconnu x 0,1 / 0,65 A partir de l’équation de la droite tracé en étalonnage externe:C inconnu