Diagnostic microbiologique des infections osseuses et articulaires Anne LEGRAND Aristide NZEUMI FANMI Biologiste Référent : Michèle de MONTCLOS DES Bactériologie, 05 Avril 2011

1. Contexte Infections graves, mortalité et morbidité ++  Importance des examens bactériologiques Diagnostic difficile car –Bactéries appartiennent à des espèces variées dont la flore commensale cutanéo- muqueuse –Bactéries à croissance lente et/ou difficile (anaérobies, Kingella kingae..) –Bactéries piégées au sein d’un biofilm

2. Étiologies bactériennes (1) Arthrite aiguë hématogène Adulte : S. aureus (68%), Streptocoques (20%), Entérobactéries (10%), N.gonorrhoeae, N.meningitidis NNé : S.aureus, S. agalactiae, Entérobactéries Nourrisson, enfant : Kingella kingae (6 mois – 4 ans), S. aureus, S. pneumoniae, S. pyogenes, N.meningitidis ↓ H. influenzae depuis vaccination Contexte clinique spécifique : Borrelia burgdoferi (Lyme) et Trophyrema whipplei (Whipple) Arthrite aiguë par inoculation directe Morsure animale : Pasteurella multocida, Capnocytophaga canimorsus Morsure rat : Streptobacillus moniliformis Morsure humaine : Eikenella corrodens Infiltration, intervention articulaire : S.aureus, SCN, Propionibacterium acnes Ostéomyélites Adulte : S. aureus NNé : S. aureus, S. agalactiae, Entérobactéries Nourrisson, enfant : S. aureus, Kingella kingae, S.pyogenes Drépanocytose : S. aureus, Salmonella spp

2. Étiologies bactériennes (2) Infection de prothèse ostéo-articulaire S. aureus (25%), SCN (25%), Streptocoques et entérocoques (10%), P.acnes (10%), BGN (10%) Conta per-opératoire ou hématogène Ostéite post-opératoire Idem infections sur prothèse Sauf fractures ouvertes : Staphylocoques, Enterobacter cloacae, P. aeruginosa, Clostridium, B. cereus Infection du pied diabétique Souvent pluri microbien : S. aureus, Entérobactéries, Streptocoques, Entérocoques, P.aeruginosa, anaérobies Spondylodiscite Conta hématogène : S. aureus (20-50%), Streptocoques, Entérocoques, SCN, Entérobactéries, M. tuberculosis (20%), Kingella kingae (enfant 6 mois - 4 ans), Brucella,Candida Post-op : SCN, P. acnes, Corynebactéries

3. Prélèvements

3.1 Modalités de prélèvement (1) Conditions d’asepsie chirurgicale  limite la contamination Délai de 15j minimum par rapport à tte ATB Multiplications des prélèvements  limite le risque de faux négatif

Prélèvements superficiels de plaies ou de fistules : par abord en zone saine et ponctions (écouvillonnage non!!!) –En pratique,prélèvements superficiels à éviter, préférer les prélèvements profonds Ponctions de pus et de liquides articulaires Biopsies percutanées sous scanner Prélèvements per-opératoires : au moins 5 en des sites anatomiques différents et si possible pathologiques macroscopiquement  multiplications ++ (Anapath +/- PCR) 3.1 Modalités de prélèvement (2)

Matériel d’ostéosynthèse (vis, ciment, tige, prothèse) Drains de Redons et liquides de drainage  reprise septique uniquement, après chirurgie  marqueurs de l’efficacité du ttt et évolution Prélèvements le long de la fiche de fixateur externe si infection (pas d’écouvillon!) 3.1 Modalités de prélèvement (2)

Fixateur externe Tiges pr prothèse de hanche Sans cimentA cimenter VIS 3.2 Exemples de matériel

Hémocultures ++ –Si fièvre et sg généraux associés aux IOA –Si arthrite, ostéomyélite, spondylodiscite –En post-op immédiate (bactériémie induite par geste chirurgical) Flacons d’hémoculture ensemencés avec le liquide articulaire 3.3 Autres prélèvements

3.4 Prélèvements à réaliser Arthrite aiguë Ponction articulaire Hémocultures Pvt porte entrée (plaie, IU…) Ostéomyélites Hémocultures ++ Biopsie osseuse Infection de prothèse ostéo-articulaire Hémocultures Ponction articulaire Prélèvements per-opératoires (au moins 5 ≠) si nvelle intervention Infection post-op Prélèvements per-opératoires lors réintervention (au moins 5 ≠) Infection du pied diabétique Biopsie osseuse percutanée Curetage du fond de l’ulcération après débridement Aspiration à l’aiguille Prélèvements per-opératoires si intervention nécessaire (au moins 5 ≠) Spondylodiscite Hémocultures (souvent négatives) Ponction-biopsie-disco-vertébrale percutanée guidée par imagerie (plusieurs prélèvements)

Prélèvements précieux, non renouvelables Acheminement rapide, dans les 2H sinon milieu de transport –Acheminement dans des sacs différents Manipulation sous PSM type 2 Broyage prélèvements solides (dispo. à billes) Prélèvements non ensemencés doivent être congelés à -20°C pr analyses complémentaires  mycobactéries, champignons, bio. moléculaire 3.5 Gestion des prélèvements

4. Examens Bactériologiques

4.1 Examen microscopique Coloration de Gram –sensibilité 6%, spécificité 99% Coloration adaptée pr appréciation semi-qt des PN Liquides articulaires –Qt des leucocytes avec formule –Recherche des micro-cristaux Arthrite septique GB > 10000/mm³ (90% PNN)

4.1 Examen microscopique CBECBSCBNREMIC Liquides d’orthopédie Gram Bleu de methylène Gram Col. adaptée rech.PN Biopsies tissus, fragments osseux Broyage ED sur broyat Broyage Gram sur broyat Broyage Gram sur broyat Broyage Pas de reco. sur l’ED Matériel d’orthopédie Pas d’ED Pas de reco. sur l’ED Disperseur universel Ultra-Turrax® à tube à usage unique

GS aérobiose, lecture précoce J1, J2, tardive J5 GS cuit supplémentée 5 à10% CO2 lecture précoce J1, J2 et tardive J5 GS ou gélose Schaedler anaérobie lecture précoce J2 ou J3 et tardive J5 à J10 Milieu liquide (bouillon Schaedler et/ou BCC) lecture jusqu’à J Mise en culture (1) REMIC 2010

Flacons d’hémoculture (+/- adsorbants ATB) Autres milieux  mycobactéries (demande spécifique ou contexte clinique ++) Incubation : –environ 35°C –géloses 5 J au moins, –milieux liquides 14J 4.2 Mise en culture (2) REMIC 2010

Liquides d’orthopédie CBECBSCBNREMIC Milieux GS air 35°C 5j Choc/PVX CO 2 35°C 5j Bouilllon Schaedler K3 35°C 21j Flacon hémoc. aérobie et anaérobie BactAlert 10j Pas de GS anaérobie 2 x GS CO 2 35°C (3j et 21j) 2 x Choc/PVX CO 2 35°C(3j et 21j) Bouillon Schaedler 35°C 21j 1 GS anaér. 35°C (3j) BCC 35°C 21j Gélose Campylo (KARM) Microaérophilie 5j G. chromogène BGN : URI4 3j Pas de flacon d’hémoc. 1 x GS CO 2 37°C 2j 2 x Choc/PVX CO 2 37°C 2j et Genbag CO 2 10j 1 GS anaér. 37°C 10j Bouillon Schaedler 37°C 10j A J10 : repiquage Schaedler sur GS 37°C anaér. et PVX CO 2 pdt 5j Flacon hémoline pr liq. Articulaires 15j Flacons d’hémoc GS aéro. 5j GS cuit supplémentée CO2, 5j GS anaér. 10j Bouillons 14j (Schaedler / BCC) Flacon hémoc. Recherche mycobactéries Envoi au CBS Systématique si stérile 24h Dmde spécifique Envoi au CBS Dmde spécifique Culture nég et clinique ++ Flacon Hémoline (pr hémocultures non automatisées)

Kit IOA de l’enfant CBE (1) Disponible au bloc pédiatrique –1 flacon d’hémoc pédiatrique –1 flacon d’hémoc anaérobie –1 poudrier stérile  Ensemencement –1 tube sec (pvt de sang)  Sérologie Culture négative à 48h –PCR syst. Bact Alert 10j Age de l’enfant <5 ans 1.Kingella kingae 2.universelle >5 ans 1.Universelle 2.Kingella kingae

Kit IOA de l’enfant CBE (2) Résultats négatifs à J7 –Tube sec  sérologie CBN Brucellose Maladie de Lyme Coxiella burnetii

Biopsies, matériel d’orthopédie CBECBSCBNREMIC Milieux Idem liquides d’orthopédie sauf : 2 géloses Schaedler Anaér. 35°C (48h et 7j) Pas d’hémoc Idem liquides d’orthopédie Idem liquides d’orthopédie sauf : Pas de flacon Hémoline GS aéro. 5j GS cuit supplémentée CO2, 5j GS anaér. 10j Bouillons 14j (Schaedler / BCC) Flacon hémoc. Recherche mycobactéries Envoi au CBS Systématique si stérile 24h Dmde spécifique Envoi au CBS Dmde spécifique Culture nég et clinique ++

4.3 Biologie moléculaire (1) Culture négative avec forte suspicion clinique et/ou ATB préalable et/ou critères biologiques (CRP, cytologie) Culture positive mais pas de critère clinique (labo conta?) PCR universelle Cible ADN ribosomal 16S ttes les bactéries) PCR spécifique (+ sensible) Cible une espèce ou un genre en fonction contexte PCR Kingella kingae >> culture REMIC 2010

4.3 Biologie moléculaire (2) CBECBSCBNREMIC Circonstances d’utilisation Enfant  cf Kit IOA Adulte PCR sur liq. art. si suspicion d’infection PCR sur pvts solides stériles fct° contexte Sur demande du service Si possible reste de pvt congelé Sur demande du service Si possible reste de pvt congelé  envoi au CBE pr PCR universelle PCR universelle (ADNr 16S) PCR spécifique

5. Interprétation

5. Interprétation (1) Complexe, il faut tenir compte : –Contexte clinique –La ou les espèces identifiées –La nature et le nb de prélèvements positifs –Le nb de milieux positifs et de colonies observées Pas de consensus définitif sur les critères bactériologiques exacts de diagnostic des IOA –Étude de plusieurs prélèvements profonds chez le même patient –Probabilité infection ↑ avec nb prélèvements positifs en culture avec la même bactérie REMIC 2010

Critère diagnostic : présence d’au moins 2 prélèvements per- opératoires ou 2 prélèvements espacés dans le temps (1 per-opératoire et 1 ponction articulaire ou hémoculture) positifs à la même bactérie (même espèce et même ATB) appartenant ou non à la flore cutanée. Identification et Antibiogramme sur tt les aspects de colonies isolées en culture 5. Interprétation (2) REMIC 2010

5. Interprétation (2) Infections aiguesInfections chroniques EDPositifSouvent négatif CulturePositive rapidement (24-48H) Lente (48h à plusieurs J) Parfois milieu liquide uniquement Mono/ polymicrobisme Monomicrobisme10-15% de polymicrobisme Aspect coloniesClassiqueParfois colonies atypiques : microcolonies (SCV), polymorphisme d’une même espèce, antibiogrammes différents pour même espèce Interprétationaisée plus délicate Caractère parfois atypique des colonies  erreur!!! SCV : S. aureus, SCN, P. aeruginosa, Enterococcus spp

Négativité de tous les prélèvements n’exclut pas une infection (manque sensibilité des cultures, infection décapitée par ATB préalable, germes à croissance difficile..) 5. Interprétation (3) Diagnostic Conduite à tenir !! Confrontation multidisciplinaire REMIC 2010

CBECBSCBNREMIC Expression résultats Qualitatif et Semi-quantitatif (nb de milieux positifs, nb de colonies, nature pvt, délai positivité…) RAS Identification et Antibiogramme Pr chaque germe Pvts per-op : limiter le nb d’ATB Sur tous les aspects de colonies isolées (SCV ++) 5. Interprétation (4)

Conclusion (1) Respect recommandations du REMIC concernant l’incubation, les milieux et l’atmosphère : bien dans l’ensemble excepté : –Pas de GS anaérobie pr liquides d’orthopédie au CBE –Pas de flacon d’hémoculture au CBS pr liq. articulaires –Disparité au niveau délai d’incubation –Plus de milieux utilisés au CBS (9 vs 5-7 CBE/CBN) Recommandations concernant les ATB –Globalement respectées mais limitation du nb ATB si prélèvements multiples

Biologie moléculaire –CBE, si culture stérile, Enfant ++ –Rares sur les autres sites Diversité des pratiques –Nécessité d’une harmonisation –Absence de consensus –Confrontation multidisciplinaire !!! Conclusion (2)

Bibliographie REMIC, 4e édition 2010 GBEA CBS, CBE, CBN E. Pilly Maladies infectieuses et tropicales, édition 2010 Recommandations de pratique clinique, infections ostéo-articulaires sur matériel (Prothèse, implant, ostéo-synthèse) SPILF 2009 Specific real-time polymerase chain reaction places Kingella kingae as the most common cause of osteoarticular infections in young children, Chometon S, Benito Y, Vandenesch F and al, Pediatr Infect Dis J May;26(5):377-81