Etude multicentrique prospective des prélèvements positifs à bacilles à Gram négatif non fermentaires (BGN-NF) Données microbiologiques Hervé Jacquier, Stéphane Corvec, Alban Le Monnier, Emmanuelle Bille, Françoise Jauréguy, Etienne Carbonnelle, Vincent Fihman, Jacques Tankovic, Vincent Cattoir

Bacilles à Gram négatif non fermentaires Habitat –Environnement –Eau Pathogénicité –Colonisation / Infection ? –Facteurs de risque  Immunodépression  Mucoviscidose  Immunocompétent → Service de réanimation → Traitement antibiotique préalable → Ventilation mécanique → BPCO Résistance aux antibiotiques +++

Identification des BGN-NF Microbiologie « conventionnelle » –Gram, mobilité, phénotype de résistance, oxydase… Systèmes d’identification commerciaux –Galerie API 20NE –Carte VITEK 2 ID-GNB –Phoenix ID –Microscan… → Identification parfois peu fiable et limitée au genre → Apport de la biologie moléculaire

Identification des BGN-NF Biologie moléculaire –Séquençage du gène rrs (gène codant l’ARN16S)  « Gold Standard »  Bonne discrimination ? –Autres cibles  gyrB chez Aeromonas (Küpfer, et al., IJSEM, 2006)  rpoB et ses régions flanquantes chez Acinetobacter (La Scola, et al., JCM, 2006) → Apport de la spectrométrie de masse MALDI-TOF → Méthodes coûteuses et longues

Spectrométrie de masse MALDI-TOF Utilisation en routine à évaluer –Seng et al., CID 2009 :  1660 isolats étudiés  95,4% d’identification : 84,4% à l’espèce et 11,1% au genre Cas particuliers –Staphylocoques à coagulase négative (Carbonnelle et al., JCM, 2007) –Streptocoques oraux (Friedrichs et al., JCM, 2007) –Anaérobies (Nagy, et al., CID, 2009) –BGN-NF isolés de patients atteints de mucoviscidose (Degand et al., JCM, 2008)

Objectifs Etude de l’épidémiologie des prélèvements cliniques positifs à BGN-NF Application de la spectrométrie de masse MALDI- TOF dans l’identification des BGN-NF en routine

Matériels et méthodes Recueil des souches –Etude prospective : décembre mai 2009 –Etude Multicentrique : 9 hôpitaux APHP et de Province –Souches inclues : BGN-NF (hors P. aeruginosa et A. baumannii) isolés de prélèvements à visée diagnostique –Prélèvements  Prélèvements cliniques : hémocultures, cathéters, prélèvements respiratoires (y compris de mucoviscidose), urines et abcès profonds Identification –Systèmes d’identification commerciaux :  Galerie API 20 NE  Carte Vitek2-GNB –Séquençage du gène codant l’ARN 16S : Gold Standard  Amorces A2/S15  1390 pb (P. Grimont, CIMB Pasteur) –Spectrométrie de masse MALDI-TOF

Matériels et méthodes Spectrométrie de masse MALDI-TOF Laboratoire de microbiologie - Hôpital Necker Conditions de culture préalable –Culture sur Müeller Hinton Agar à 37°C Spectromètre de masse MALDI-TOF –Microflex Bruker –Voltage 20kV –m/z = 2000  –200 impacts

Spectrométrie de masse MALDI-TOF Degand et al., JCM, 2008

Résultats Epidémiologie des prélèvements cliniques positifs à BGN-NF

Résultats Prélèvements Prélèvements : n= % 17% 14,9% 13,2% 15,9%

Prélèvements : n= 181 Prélèvements mono/plurimicrobiens –54% des prélèvements monomicrobiens Prélèvements profonds / Superficiels –70% de prélèvements profonds Prélèvements pulmonaires –1/3 mucoviscidose –2/3 non-mucoviscidose Recrutement multicentrique : diversité Résultats Prélèvements

Résultats Nombre de souches recueillies : n=182 –Diversité : 36 espèces différentes –Espèces prédominantes  Stenotrophomonas maltophilian=71 (39%)  Achromobacter xylosoxidansn=24 (13,2%)  Pseudomonas putida groupn=17 (9,3%) → 3 espèces représentent > 50% des souches

Résultats Prélèvements respiratoires Patients non mucoviscidose n=53 Patients mucoviscidose n=19 n=5 n=8 n=4 n=2 n=29 n=10 n=2 n=12

Résultats Hémocultures et ECBU Hémocultures (n=30) –Diversité : 15 espèces différentes –Espèces prédominantes  Stenotrophomonas maltophilian=7 (23,3%)  Pseudomonas putida groupn=6 (20%) Urines (n=27) –Diversité : 11 espèces différentes –Espèces prédominantes  Stenotrophomonas maltophilian=7 (25,9%)  Pseudomonas putida groupn=7 (25,9%)

Résultats Identification Application de la spectrométrie de masse MALDI-TOF

Résultats Différentes méthodes d’identification n=172 souches API 20NEVITEKMALDI-TOF ND062 Absence d’identification 2284 Identification erronée 321 Id° genre20 16 Id° espèce ,6% 12% 73,8% 81,9% 9,4% 87,6% 97,1%

Résultats Différentes méthodes d’identification n=101 souches (S. maltophilia exclus) API 20NEVITEKMALDI-TOF ND061 Absence d’identification 2284 Identification erronée 321 Id° genre20 16 Id° espèce ,8% 21% 55,4% 68,4% 16% 79% 95%

Résultats Analyse des résultats de MALDI-TOF Absence d’identification (n=4): –Comamonas kerstersii –Kerstersia gyiorum –Psychrobacter phenylpyruvicus –Shewanella algae Erreur d’identification (n=1): –Identification rendue Alcaligenes faecalis pour un Roseomonas mucosa

Résultats Identification limitée au genre n=16 16SMALDI Acinetobacter johnsonniiAcinetobacter spp. Acinetobacter schindleriAcinetobacter baumanii Acinetobacter ursingiiAcinetobacter baumanii Acinetobacter ursingiiAcinetobacter sp Burkholderia cenocepacia / cepaciaBurkholderia sp Cupriavidus pauculusCupriavidus gilardii Pseudomonas fluorescens groupPseudomonas putida Pseudomonas putida groupPseudomonas fluorescens Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas putida groupPseudomonas fluorescens Pseudomonas putidaPseudomonas fluorescens Pseudomonas putidaPseudomonas putida/fluorescens Pseudomonas putidaPseudomonas putida/fluorescens Pseudomonas putidaPseudomonas fluorescens Pseudomonas putidaPseudomonas fluorescens Pseudomonas stutzeriPseudomonas pseudoalcaligenes

Discussion BGN-NF : –Limites Colonisation / Infection ? –Classification changeante  Impact taxonomique  Impact clinique ? –Gène rrs : le bon « Gold Standard » ? –MALDI-TOF : technique prometteuse  Rapidité  Coût  Identification dans 97,1% des cas  Dynamique de la base de données

Jacques TANKOVIC Remerciements Pr Xavier NASSIF Emmanuelle BILLE Jean-Ralph ZAHAR Jean-Luc BERETTI Brunhilde DAUPHIN Julie MEYER Julie LETO Hôpital Necker Enfants Malades Françoise JAUREGUY CHU Avicenne Alban LE MONNIER CH Versailles CHU Saint-Antoine Vincent CATTOIR Jocelyn MICHON Michel AUZOU CHU Caen Stéphane CORVEC Marina ILLIAQUER CHU Nantes Vincent FIHMAN CHU Louis Mourier Etienne CARBONNELLE Jonathan RAMAHEFASOLO CHU HEGP Marie-José SANSON-LE-PORS Laurent RASKINE CHU Lariboisière

MERCI DE VOTRE ATTENTION

Résultats Répartition par service