La démarche diagnostique bactériologique Votre rôle Penser à une infection Penser à une infection bactérienne Faire la preuve de l’infection bactérienne Vous donner les moyens d’attendre la confirmation Adapter la conduite à tenir et la thérapeutique Faire le(s) bon(s) prélèvement(s), dans les bonnes conditions, au bon moment, Connaître les bactéries pathogènes, le profil classique de sensibilité au traitement les conditions de leurs isolements,

L’analyse diagnostique bactériologique Pour le diagnostic direct de l’infection Voir, isoler, prouver la virulence de la bactérie et proposer le schéma thérapeutique prélèvement EXAMEN DIRECT CULTURES IDENTIFICATION SENSIBILITE AUX ANTIBIOTIQUES Pour le diagnostic indirect de l’infection SEROLOGIE RECHERCHE ANTIGENES BACTERIENS

+ L’analyse diagnostique bactériologique (suite) Premier jour PRELEVEMENT Plusieurs techniques Milieux transports EXAMEN DIRECT CULTURES Premier jour Plusieurs supports Plusieurs conditions + Première classification Conditions de prélèvement +++ Interprétation +++ Adaptation +++

+/- L’analyse diagnostique bactériologique (suite) IDENTIFICATION Méthodes variables Standardisation +/- SENSIBILITE ANTIBIOTIQUES Fonction de l’identification Technique de référence Milieux liquides Deuxième classification Deuxième Jour

EXAMEN DIRECT Colorations spécifiques Colorations classiques Les techniques d’observation : MICROSCOPIE Deux principes Non fixé, état frais Fixé, marqué ou coloré Mobilité bactérienne Présence de bactéries Agencement bactérien Présence de bactéries Présence de réaction cellulaire Forme bactérienne Affinité colorant GRAM +++ Colorations spécifiques Bleu de Méthylène Colorations classiques Ziehl Neelsen (résistance acido-alcoolique, BAAR) Colorations des germes intracellulaires Marquage Ag de paroi spécifique avec Ac fluorescent

CULTURES SOLIDES LIQUIDES Types de milieux Automate de détection En boîtes, en tubes Types de milieux Standard ou minimun (tryptica-soja) Enrichis (sang, charbon, sang cuit) Sélectif (détergent, cristaux, Antibiotique) Synthétique (une seule source de carbone et énergie) Conditions de culture Orientation particulière Standard

IDENTIFICATION Les techniques d’identification PHENOTYPIQUE Diagnostic d’orientation Aspect des colonies en culture Profil de sélectivité des cultures Tests rapides Catalase Microscopie Mobilité Forme Spores Oxydase Confirmation Profil biochimique Profil chromatographique de la paroi (spécialisé) Recherche de marqueurs de virulence spécifiques (toxines ++) Séro-groupage (kits commerciaux limités mais standard) Sensibilité à des réactifs particuliers (composé O129, optochine)

IDENTIFICATION (suite) Les techniques d’identification GENOTYPIQUE Principe À partir de cultures bactériennes Extraction du matériel génétique À partir de prélèvement (indication limitée) Matériel ADN +++ Etude du matériel nucléique obtenu Matériel ARN parfois Analyse d’homologie de séquence Indirecte (restriction) Directe (amplification) Gel en Champ pulsé Hybridation sur membrane Biopuce Séquençage Recherche d’un gène particulier et spécifique Gène ARN16S Gène de virulence Applications Diagnostic bactériologique difficile ou impossible Diagnostic bactériologique long Intérêt à discuter +++

IDENTIFICATION (suite) Extraction ADN Amplification Hybridation Signaux positifs Restriction Séparation Analyse comparative des signaux 1 2 5 4 3 7 6 Gène à étudier Amplification PCR Analyse de séquence comparative référence

Orientation vers diagnostic bactériologique Examen direct interprété (site de prélèvement) Faire la distinction entre flore normale, de colonisation …et l’infection Flores commensales Cutanée : Staphylocoques coag neg, Enterococcus ssp corynébactéries, Acinetobacter ssp, propionibacterium ssp Oro-pharyngée: Streptococcus ssp, anaérobies, Neisseria ssp, corynébactéries Digestive : Anaérobies, Escherichia coli, Entérobactéries Vaginale : Lactobacilles

Orientation vers diagnostic bactériologique (suite) Infection Sites fermés et stériles Colonisation anormale Présence d’une modification de la flore commensale Sites ouverts mais normalement stériles Recherche de la réponse cellulaire (présence Pnn) Pathogènes opportunistes Statut de l’hôte Immunodépression sévère Complications chirurgicales Pathogènes « obligatoires » Virulence bactérienne Toxines +++

Exemples Infection Colonisation anormale Modification flore Liquide Céphalo-rachidien Articulaire Prélèvements pour ECBU Colonisation anormale Prélèvement de Selles Modification flore